检索结果-内蒙古大学图书馆

国内首株猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)的分离鉴定

中国预防兽医学报 2016年第3期38卷 171-174页

作者：陈建飞王潇博焦贺勋时洪艳张鑫刘建波石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150001

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现。2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV。目前... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现。2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV。目前,只有美国成功分离到2株PDCoV。为分离鉴定PDCoV,本研究将PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾细胞(LLC-PK)并连续传代培养。通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光和基因序列测定对细胞培养物进行鉴定。结果表明我们成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。M基因的系统发育分析表明NH株与中国、美国及韩国的PDCoV亲源关系较近。本研究为进一步研究PDCoV的致病性和致病机制奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒细胞培养分离鉴定

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PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2008年第6期38卷 494-499页

作者：王小武符芳柴政孔令达蔡雪辉宋淑萍许红喜李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PC... 详细信息

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法。敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL。表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光 PCR

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NPM1 K263 SUMO化位点在PEDV N蛋白与NPM1共定位中的作用

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中国预防兽医学报 2017年第11期39卷 940-942页

作者：季朝阳石达陈建飞王潇博时洪艳张鑫冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为阐明细胞核仁蛋白NPM1与猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N蛋白)共定位的关键位点。本实验通过设计突变引物,利用重叠延伸PCR方法对NPM1氨基酸位点T199、K230和K263进行定点突变,分别将其克隆至真核表达载体pDsRed2-N1中,获得重组质... 详细信息

为阐明细胞核仁蛋白NPM1与猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N蛋白)共定位的关键位点。本实验通过设计突变引物,利用重叠延伸PCR方法对NPM1氨基酸位点T199、K230和K263进行定点突变,分别将其克隆至真核表达载体pDsRed2-N1中,获得重组质粒pDsRed2-NPM1(T199A)、pDsRed2-NPM1(K230R)、pDsRed2-NPM1(K263R)。随后分别将pDsRed2-NPM1(WT)、pDsRed2-NPM1(T199A)、pDsRed2-NPM1(K230R)、pDsRed2-NPM1(K263R)与重组质粒pAcGFP-N共转染VeroE6细胞。共聚焦结果显示NPM1(T199A)、NPM1(K230R)、野生型NPM1均与N蛋白共定位于细胞的核仁中。虽然NPM1(K263R)与N蛋白具有共定位现象,但两者共定位于细胞核中。该实验结果为进一步研究核仁蛋白NPM1参与PEDV复制的分子机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核仁蛋白NPM1 定点突变

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猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 173-176页

作者：刘随新石达陈建飞张鑫时洪艳刘孝珍张莎王璐冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接... 详细信息

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核仁定位信号流式细胞术宿主细胞周期

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猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2009年第11期31卷 864-868页

作者：张兴娟孙元刘大飞仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 扬州大学兽医学院江苏扬州225009

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用BstDNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入SYBR GreenⅠ... 详细信息

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用BstDNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果。该方法可检测出不同基因型的CSFV野毒株,其检出极限为2.5TCID50的CSFV,与实时荧光定量RT-PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率达100%,与引物-探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%。该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法。

关键词：猪瘟病毒野毒株 RT-LAMP 鉴别诊断

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高致病性PRRS活疫苗(HuN4-F112株)抗体对Ⅱ型不同亚群PRRSV的中和效果

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 401-404页

作者：孟甄祥安同庆陈家锃宫大庆冷超粮刘飞李登云彭金美孙艳吴玉全吴江郭娟娟杨永倩童光志田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)活疫苗(HuN4-F112株)诱导的抗体对II型不同亚群PRRSV的中和作用,本研究将10头PRRSV抗原、抗体阴性的6周龄仔猪,每头仔猪肌肉注射1头份疫苗(106.0TCID50/mL),每周采血并分离血清,检测该... 详细信息

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)活疫苗(HuN4-F112株)诱导的抗体对II型不同亚群PRRSV的中和作用,本研究将10头PRRSV抗原、抗体阴性的6周龄仔猪,每头仔猪肌肉注射1头份疫苗(106.0TCID50/mL),每周采血并分离血清,检测该血清对II型PRRSV第1、2、4亚群的代表病毒株勃林格PRRSV活疫苗(VR-2332株)、PRRSV活疫苗(CH-1R株)和HP-PRRSV活疫苗(HuN4-F112株)的中和效价。实验结果显示,仔猪免疫3周后开始产生针对HuN4-F112的中和抗体,11周至22周抗体水平达到高峰,抗体持续至少25周,但只有少数免疫猪在几个时间点的血清对VR-2332和CH-1R疫苗株具有血清交叉中和作用,而且中和效价较低。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体 HuN4.F1 12

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猪德尔塔冠状病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国动物传染病学报 2021年第3期29卷 64-70页

作者：范前进刘秋歌石达王潇博张家林汤荣锋陈建飞冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZv... 详细信息

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶蛋白纯化试剂盒进行纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,利用Western blot和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示:筛选获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株17C7和23F3,单克隆抗体的亚型均为IgM,腹水效价均为1∶6400;两株单克隆抗体都与S蛋白有良好的反应性,且能够与PDCoV发生特异性反应,而与其他常见的猪腹泻冠状病毒不发生反应。本研究为PDCoV诊断及病毒入侵、感染机制的研究奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 S蛋白真核表达单克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录环媒恒温检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2009年第5期31卷 378-382页

作者：陈长木崔尚金张超范鄢明华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150000 天津农业科学院畜牧兽医研究所天津300112

本研究利用PrimerExplorer V4软件设计了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N基因保守区6个特异性部位的4种引物,建立了PRRSV的反转录环媒恒温检测方法。利用该方法所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用1 h即可得到其特有的阶梯状条带,... 详细信息

本研究利用PrimerExplorer V4软件设计了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N基因保守区6个特异性部位的4种引物,建立了PRRSV的反转录环媒恒温检测方法。利用该方法所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用1 h即可得到其特有的阶梯状条带,而且猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和健康猪睾丸细胞的扩增结果均为阴性。本方法对PRRSV的最低检出量为1×100个～1×101个基因拷贝。反转录环媒恒温检测方法和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为96.2%。该方法为现地开展猪繁殖与呼吸综合征的快速诊断和综合防治方案的提出提供了有力的诊断工具。

关键词： PRRSV 环媒恒温检测方法

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基于牛呼吸道合胞体病毒融合前F蛋白的间接ELISA方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1126-1130,1158页

作者：王磊常继涛于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗... 详细信息

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗牛Ig G-HRP的稀释度为1:8000,抗体阴阳性临界值为0.204。特异性试验结果显示,该ELISA方法与阿卡斑病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,当BRSV阳性血清稀释倍数达1∶6400时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感性。重复性试验结果显示,ELISA组内、组间最大变异系数分别为6.80%和8.80%,表明该方法的重复性良好。对195份临床牛血清样品检测结果显示,BRSV抗体阳性率为61.0%;对其中的143份血清同时进行病毒中和试验检测,结果显示二者符合率为89.5%。上述结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于牛群中BRSV抗体的检测,为BRSV的血清流行病学调查提供可靠的技术手段。

关键词：牛呼吸道合胞体病毒融合前的F蛋白间接ELISA 抗体检测

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J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

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中国畜牧兽医 2012年第4期39卷 42-46页

作者：徐延伟高宏雷高玉龙李凯高立秦立廷祁小乐王永强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经SalⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得... 详细信息

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经SalⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。

关键词： J亚群禽白血病 gp85基因毕赤酵母分泌表达

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