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国际免疫学杂志 2009年第3期32卷 176-179页

作者：王菁华白莎莎孟庆峰王广友穆莉莉孙博王丹丹孔庆飞刘玉梅李呼伦哈尔滨医科大学神经生物学教研室哈尔滨医科大学神经生物省高校重点实验室 150081 伊春市南岔区公安分局技术中队 153100

目的分析微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中蛋白质表达的差异。方法用旋转细胞培养系统提供的微重力环境进行神经细胞微重力培养。应用表面增强激光解吸离子化（SELDI）蛋白质芯片技术检测微重力和正常重力条件下神... 详细信息

目的分析微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中蛋白质表达的差异。方法用旋转细胞培养系统提供的微重力环境进行神经细胞微重力培养。应用表面增强激光解吸离子化（SELDI）蛋白质芯片技术检测微重力和正常重力条件下神经细胞培养上清液的蛋白质谱。用PBSII—C型蛋白质芯片阅读机读取数据，采用Ciphergen Protein Chip3．2．1软件分析数据。结果WCX2两种蛋白芯片共捕获246个蛋白峰，发现14个差异蛋白。与正常重力培养组蛋白谱相比，11个蛋白在微重力培养后高表达，3个蛋白在微重力培养后低表达。结论微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中存在差异蛋白表达，这些差异蛋白为进一步了解失重对神经细胞的影响提供了重要线索。

关键词：模拟微重力神经细胞旋转式细胞培养系统蛋白芯片

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鼠抗人CD20单克隆抗体的制备与鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第5期25卷 454-456页

作者：包红霞吴春铃李淑珍唐晓波褚晓杰王爽张家宁朱大岭哈尔滨医科大学药学院生物制药学教研室哈尔滨医科大学黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地哈尔滨医科大学药物与内源性物质代谢省高校重点实验室黑龙江哈尔滨150081

目的:制备CD20融合蛋白及制备CD20的单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定。方法:以人单核细胞cD-NA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CD20(即CD20-GST)和pET-32a-CD20(即CD20-His)。以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠... 详细信息

目的:制备CD20融合蛋白及制备CD20的单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定。方法:以人单核细胞cD-NA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CD20(即CD20-GST)和pET-32a-CD20(即CD20-His)。以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠制备(mAb),用间接ELISA法测定抗体的效价,Western blot、免疫荧光鉴定其特异性及免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位。结果:CD20-GST和CD20-His蛋白在大肠杆菌中可高效表达,经纯化后可获得高纯度的CD20蛋白,经细胞融合得到1株稳定分泌CD20抗体的杂交瘤细胞株,Western blot和免疫组化显示抗CD20mAb与CD20蛋白具有良好的反应性。结论:成功制备高纯度CD20蛋白并以此为抗原制备了1株能够稳定分泌抗人CD20的鼠mAb的杂交瘤细胞株BD11F4,为进一步研究CD20对非霍奇金淋巴瘤的诊断治疗提供基础。

关键词： CD20 原核表达融合蛋白抗体制备

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白细胞介素17及其受体在脑缺血损伤中作用的初步研究

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中风与神经疾病杂志 2009年第6期26卷 653-656页

作者：张喆李国忠丁兆明王广友张瑶彭雷李瑶李呼伦王丹丹哈尔滨医科大学神经生物学教研室黑龙江省神经生物重点实验室黑龙江哈尔滨150081 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科黑龙江哈尔滨150001

目的在建立小鼠大脑中动脉永久性栓塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)的基础上,探讨白细胞介素17(Interleukin-17,IL-17)及其受体IL-17 Receptor(IL-17R)在缺血脑组织中的表达及对神经元的损伤作用。方法体内实验:通过线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉栓塞模型,HE观察脑组织形态学改变,ELISA与免疫组织化学技术分别检测小鼠pMCAO血清及缺血脑组织中IL-17的表达。免疫荧光检测Th17及IL-17R的表达。体外实验:原代培养的神经元经氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)处理2h,MTT检测不同剂量IL-17对神经元的损伤作用。结果体内实验:ELISA结果证实随着缺血时间延长,IL-17含量增加,与对照组相比,于24h出现差异(P24h<0.05,P2d、6d<0.001)。免疫组织化学结果显示,缺血侧脑皮质及血管周围存在IL-17的表达,经免疫荧光鉴定缺血脑组织中有Thelper 17细胞(Th17)的表达;同时脑血管内皮细胞表达IL-17R。体外实验:MTT结果显示IL-17加剧了神经元的厌氧损伤,与单纯神经元厌氧培养组相比有意义,P10ng/ml IL-17<0.05,P100ng/ml IL-17<0.01,且高浓度(100ng/ml)IL-17与低浓度(10ng/ml)IL-17对神经元的刺激干预相比较,高浓度的IL-17对神经元活性损伤大。结论(1)IL-17与IL-17R参与了脑缺血损伤过程;(2)缺血侧脑实质内存在Th17及IL-17R的表达;(3)IL-17加剧了缺血缺氧条件对神经元有损伤作用,且存在剂量依赖性。

关键词：脑缺血 IL-17 IL-17R Th17

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抗人羧酸酯酶-Ⅱ多克隆抗体的制备、鉴定及应用

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第2期25卷 158-160,163页

作者：吴春铃包红霞唐晓波朱大岭哈尔滨医科大学药学院生物制药学教研室黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地药物与内源性物质代谢省高校重点实验室黑龙江哈尔滨150081

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His)。在... 详细信息

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His)。在宿主菌BL21内进行诱导表达,hCE-Ⅱ-GST融合蛋白作为免疫原免疫大耳白兔,用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用间接ELISA、West-ernblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果:成功制备了抗hCE-Ⅱ的多克隆抗体。Westernblot鉴定表明该抗体可特异性识别重组蛋白以及天然的人肝微粒体蛋白。免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性结合肝包浆中的hCE-Ⅱ蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合。结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础。

关键词： hCE-Ⅱ 原核表达融合蛋白多克隆抗体

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Th17及IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力发病过程的相关性

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中国生物制品学杂志 2008年第12期21卷 1039-1042页

作者：孔庆飞穆莉莉孙博李娜王广友翟东旭白莎莎张淑娟李呼伦哈尔滨医科大学神经生物学教研室哈尔滨医科大学神经生物省重点实验室哈尔滨150081

目的探讨Th17及其相关因子IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)发病过程的相关性。方法建立EAMG大鼠模型及CFA对照组,分别于两发病时相(早期发病高峰和晚期发病高峰),采用ELISA法检测血清以及淋巴细胞培养上清中IL-17的含量;流式... 详细信息

目的探讨Th17及其相关因子IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)发病过程的相关性。方法建立EAMG大鼠模型及CFA对照组,分别于两发病时相(早期发病高峰和晚期发病高峰),采用ELISA法检测血清以及淋巴细胞培养上清中IL-17的含量;流式细胞仪检测CD4+IL-17+淋巴细胞含量;3H增殖试验检测淋巴细胞的增殖能力;B-ELISPOT法检测B细胞的抗体分泌情况。结果与CFA组相比,EAMG组大鼠血清、淋巴细胞培养上清中IL-17的表达以及CD4+IL-17+淋巴细胞含量在早期发病时相差异均无统计学意义;而在晚期发病时相则均明显增多。与非刺激组相比,IL-17的刺激对CFA和EAMG组淋巴细胞的增殖能力及B细胞抗体分泌水平,在早期发病时相均无明显影响;而在晚期发病时相,EAMG组均明显升高。结论Th17及其相关因子IL-17参与大鼠EAMG的晚期发病时相,并促进疾病的发展。

关键词： Th17 IL-17 实验性自身免疫性重症肌无力发病

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伏立康唑PLGA纳米微粒的制备及其形态和释放特点分析

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中国生物制品学杂志 2008年第1期21卷 42-44,53页

作者：吕桂香彭海生刘希君王菁华孙博戢玉环赵然王琪王广友王丹丹李呼伦哈尔滨医科大学基础医学院神经生物学教研室哈尔滨医科大学神经生物省重点实验室哈尔滨150081

目的制备伏立康唑PLGA纳米微粒,并分析其形态及释放特点。方法采用乳化-溶剂挥发法制备伏立康唑PLGA纳米微粒,用激光粒径分析仪及扫描电镜分别进行分散性和形态学分析,经HPLC分析其载药量及释放特点。结果经激光粒径分析,样品粒径峰值为... 详细信息

目的制备伏立康唑PLGA纳米微粒,并分析其形态及释放特点。方法采用乳化-溶剂挥发法制备伏立康唑PLGA纳米微粒,用激光粒径分析仪及扫描电镜分别进行分散性和形态学分析,经HPLC分析其载药量及释放特点。结果经激光粒径分析,样品粒径峰值为(126±20)nm,分布指数为1.5。电镜观察颗粒分布均匀,表面光滑。HPLC分析载药量为(1.9±0.6)%,包封率约为12%,24h内存在突释,第2天到第8天缓慢释放。结论已成功制备了伏立康唑PLGA纳米微粒,能实现缓慢释放,减少给药次数的目的。

关键词：伏立康唑聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微粒控制释放

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IL-17对髓鞘碱性蛋白诱导鼻黏膜免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响

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中国生物制品学杂志 2008年第7期21卷 598-601页

作者：邓晓波孙博孔庆飞张瑶王菁华靳轶敏王秀云李呼伦王广友黑龙江省医院道外分院哈尔滨150020 哈尔滨医科大学神经生物学教研室哈尔滨医科大学神经生物省重点实验室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学附属第一医院哈尔滨150001

目的探讨IL-17对髓鞘碱性蛋白(MBP)68-86诱导鼻黏膜免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的影响。方法将大鼠分为5组,分别经鼻黏膜滴注PBS、MBP68-86、MBP68-86+IL-17(0.01μg/d)、MBP68-86+IL-17(0.05μg/d)和MBP68-86+IL-17(0.1μg/d)诱导其发生免疫耐受,并在此基础上建立EAE动物模型,观察各组大鼠发病情况;通过3H掺入试验检测特异性抗原MBP68-86多肽诱导T淋巴细胞增殖活性;HE染色观察脊髓淋巴细胞浸润情况,免疫组化方法检测脊髓中单位面积IL-17+细胞数。结果PBS组和IL-170.1μg/d组与MBP组相比,大鼠免疫后出现进食减少、体重减轻、尾瘫、后肢瘫痪等临床症状,IL-170.01μg/d组和0.05μg/d组大鼠临床症状较轻或无症状。淋巴细胞增殖试验结果显示,PBS组和IL-170.1μg/d组与MBP组相比,特异性淋巴细胞增殖反应显著增高,IL-170.01μg/d组和0.05μg/d组与MBP组相比,差异无显著意义,与IL-170.1μg/d组相比差异有显著意义;PBS组、IL-170.1μg/d组与MBP组、IL-170.01μg/d组和0.05μg/d组相比,脊髓切片中淋巴细胞浸润面积较大且细胞数量较多,IL-17+细胞数也显著增多。结论MBP68-86特异性肽段可诱导EAE免疫耐受的形成,预防EAE的发生;鼻黏膜给予IL-17可以打破MBP诱导的特异性免疫耐受,且存在剂量依赖性。

关键词：实验性自身免疫性脑脊髓炎髓鞘碱性蛋白鼻黏膜免疫耐受白细胞介素-17

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NK1．1^＋细胞在实验性重症肌无力发病机制中的作用

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中国免疫学杂志 2008年第1期24卷 38-41,48页

作者：王菁华孙博李国忠王丹丹刘玉梅王琪穆莉莉金连弘李呼伦哈尔滨医科大学神经生物教研室哈尔滨医科大学神经生物学黑龙江省高校重点实验室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科哈尔滨150081

目的:探讨NK1.1+细胞在重症肌无力疾病进展中发挥的作用以及其调节机制。方法:(1)用腹腔注射抗NK1.1抗体和抗TGF-β抗体的方法制造NK1.1+细胞缺陷和TGF-β缺陷的小鼠模型;(2)通过肌无力评分标准来评价试验组和对照组小鼠之间实验性自身... 详细信息

目的:探讨NK1.1+细胞在重症肌无力疾病进展中发挥的作用以及其调节机制。方法:(1)用腹腔注射抗NK1.1抗体和抗TGF-β抗体的方法制造NK1.1+细胞缺陷和TGF-β缺陷的小鼠模型;(2)通过肌无力评分标准来评价试验组和对照组小鼠之间实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的发病情况和病情严重程度的区别;(3)观察淋巴细胞增殖以及应用ELISA方法检测细胞因子TGF-β、抗AchRIgG的各种亚型。结果:(1)NK1.1+细胞缺陷的小鼠同对照组小鼠相比EAMG发病时间延迟且病情严重程度明显降低,但在免疫后7天用抗NK1.1处理却不能改变EAMG的临床病程。(2)NK1.1+细胞缺陷没有明显改变由AchR刺激产生的T细胞增殖反应,但由AchR特异性T细胞所产生的TGF-β有明显的增高。(3)经TGF-β中和抗体处理的NK1.1+细胞缺陷的小鼠其EAMG的进展明显加快。(4)NK1.1+细胞缺陷鼠血清中抗AchRIgG、AchRIgG2b亚型的含量下降。结论:NK1.1+细胞在EAMG的起始时发挥重要的作用,并且NK1.1+细胞的缺失将导致AchR特异性T细胞产生TGF-β的增加,从而抑制了重症肌无力的进展。

关键词：实验性自身免疫性重症肌无力 NK1.1^+ 细胞细胞因子 TGF—β

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骨髓基质干细胞对大鼠肝纤维化细胞凋亡的影响

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中国生物制品学杂志 2008年第11期21卷 929-932页

作者：史立军王菁华徐克达曹振远孙博王广友王丹丹孔庆飞李呼伦哈尔滨医科大学附属第一医院哈尔滨150001 哈尔滨医科大学神经生物学教研室哈尔滨医科大学神经生物省重点实验室哈尔滨150081 黑龙江省双鸭山煤炭总医院消化内科双鸭山155100

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠肝纤维化细胞(CFSCs)凋亡的影响。方法常规培养BMSCs、CFSCs和大鼠肝细胞系BRL,并双层共培养CFSCs与BMSCs。用ELISA方法检测BMSCs培养上清中NGF、HGF和TGF-β1的浓度;RT-PCR检测与BMSCs共培养的CFSC... 详细信息

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠肝纤维化细胞(CFSCs)凋亡的影响。方法常规培养BMSCs、CFSCs和大鼠肝细胞系BRL,并双层共培养CFSCs与BMSCs。用ELISA方法检测BMSCs培养上清中NGF、HGF和TGF-β1的浓度;RT-PCR检测与BMSCs共培养的CFSCs及BRL的p75表达;TUNEL法检测BMSCs分泌的细胞因子封闭后对CFSCs凋亡的影响。结果BMSCs可分泌NGF、HGF、TGF-β1等细胞因子,且随着培养时间的延长,其分泌量逐渐增多;BRL不表达p75,CFSCs表达p75,且与BMSCs共培养后,其表达量增高;分别用p75的阻断剂TAT-Pep5、HGF的中和抗体和JNK的阻滞剂sp600125作用后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例均明显降低;封闭TGF-β1后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例增高。结论BMSCs能够通过分泌NGF和HGF促进CFSCs的凋亡,这种凋亡诱导作用依赖于JNK的活性,并且在封闭TGF-β1后增强。

关键词：骨髓基质干细胞肝纤维化细胞细胞因子凋亡大鼠

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骨髓基质干细胞抑制大鼠肝纤维化细胞生长的实验研究

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国际免疫学杂志 2008年第6期31卷 405-407页

作者：王淑芳唐印华薄挽澜徐克达曹振远王菁华李呼伦史立军哈尔滨医科大学附属第一医院消化内科 150001 黑龙江省双鸭山煤炭总医院消化内科 155100 哈尔滨医科大学附属第一医院介入科 150001 哈尔滨医科大学神经生物学教研室哈尔滨医科大学神经生物省重点实验室150081

目的探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）对大鼠肝纤维化细胞（CFSCs）生长的抑制作用。方法采用不同培养时间BMSCs的培养上清培养大鼠正常肝细胞系（BRL）以及CFSCs，MTr法检测CFSCs的增殖情况；Transwell建立BMSCs与CFSCs的双层共培养体系，... 详细信息

目的探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）对大鼠肝纤维化细胞（CFSCs）生长的抑制作用。方法采用不同培养时间BMSCs的培养上清培养大鼠正常肝细胞系（BRL）以及CFSCs，MTr法检测CFSCs的增殖情况；Transwell建立BMSCs与CFSCs的双层共培养体系，经TUNEL法检测与BMSCs按不同比例进行培养后的CFSCs凋亡情况。结果BMSCs培养上清作用于CFSCs后，其增殖能力明显低于对照组，有统计学意义（P〈0．05），并表现出剂量依赖性，而对BRL没有作用。CFSCs与BMSCs按不同比例共培养后，随着BMSCs比例的增加，CFSCs调亡率上升。结论BMSCs能够不可逆的抑制CFSCs生长而不影响正常的肝细胞，这种生长抑制是通过诱导CFSCs的凋亡发生的。

关键词：骨髓基质干细胞肝纤维化细胞生长抑制调亡

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