检索结果-内蒙古大学图书馆

水产学报 2007年第6期31卷 731-736页

作者：王蓓吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524025

应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建溶藻弧菌poly（A）化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly（A）化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进... 详细信息

应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建溶藻弧菌poly（A）化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly（A）化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进行测序,根据测序结果进行生物信息学分析和结果验证。实验结果表明,我们成功地构建了溶藻弧菌poly （A）化mRNA的cDNA文库,获得一百多个基因片段并对其中53个基因片段进行测序分析,获得了如细菌Ⅲ型分泌系统易位蛋白、趋药性传感器、类丝氨酸蛋白酶等毒力相关因子的基因片断。并且在一定程度上证实了poly（A）化在细菌中不是个别和偶然的现象。实验结果说明了我们所构建的溶藻弧菌poly（A）化mRNA的cDNA文库质量高,文库基因片段的重复性低,筛选基因片段效率高、目的性强。本文并探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly（A）化mRNA的cDNA1文库构建中的应用价值。

关键词：溶藻弧菌 cDNA文库限制性显示PCR

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温度对溶藻弧菌HY9901株致病性相关蛋白的调控

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水生生物学报 2008年第6期32卷 787-793页

作者：庞欢瑛吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524025

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶(Extracelluar protease,ECPase)表达量以及胞外产物(Extracellular product,ECP)对动物的致死性。结果表明,随着温度升高,菌液浓度、ECP... 详细信息

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶(Extracelluar protease,ECPase)表达量以及胞外产物(Extracellular product,ECP)对动物的致死性。结果表明,随着温度升高,菌液浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率先升高后下降。28℃培养的细菌浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率均为最大。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同温度培养下细菌的ECP和外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP),结果显示,不同温度培养的溶藻弧菌ECP和OMP电泳图谱不同。溶藻弧菌主要ECP的分子量为70kD和62kD。ECP 70kD在20℃时的表达量最大,而28℃时ECP62 kD的蛋白浓度最高。45kD OMP随着温度升高,其合成量增大,28℃时达最大值;而40kD和34kD OMP则随着温度的升高而减弱。通过研究电泳纯化的ECP 62kD和ECP 70kD的酶活性和致死试验,证明ECP 62kD具有很强的酶活性和毒性,而ECP 70kD仅具有弱的酶活性和毒性。

关键词：溶藻弧菌胞外产物外膜蛋白胞外蛋白酶温度

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红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα抗原基因的克隆与表达分析

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水产学报 2012年第10期36卷 1482-1492页

作者：张新中鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码... 详细信息

为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码354个氨基酸残基。BLAST分析显示,红笛鲷MHCⅠα与其他已知物种MHCⅠα基因的最高同源性为84%。构建的系统进化树显示,红笛鲷MHCⅠα与石斑鱼等MHCⅠα亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,MHCⅠα在头肾中的最大表达量出现在哈氏弧菌ZJ0706诱导后6～15 h内;构建的重组表达质粒pET32a-MHCⅠα经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了正确表达。将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后免疫新西兰纯种大白兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示,所获得的兔抗血清效价约为1∶40 000。Western blot检测发现,本实验制备的抗血清能特异性地与重组蛋白发生抗原抗体反应。

关键词：红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα) 原核表达克隆 cDNA末端快速扩增技术(RACE)

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地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

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华中农业大学学报 2009年第4期28卷 459-462页

作者：周凤丽简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524025

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针。分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针... 详细信息

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针。分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低。说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强,简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测。

关键词：溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针外膜蛋白DNA探针斑点杂交

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湛江卵形鲳鲹致病链球菌的分离、鉴定及药敏实验

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基因组学与应用生物学 2019年第12期38卷 5403-5411页

作者：武沛文宋大伟郭丹玲庞欢瑛汤菊芬简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

为了确定2017年6月至2017年9月湛江市太平镇网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)疑似发生鱼链球菌病的病原菌及其毒力特性,取病鱼的脑、肝脏、脾脏和肾脏在血平板上进行分离培养,将分离培养的病原菌对卵形鲳鲹进行人工回归感染实验,... 详细信息

为了确定2017年6月至2017年9月湛江市太平镇网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)疑似发生鱼链球菌病的病原菌及其毒力特性,取病鱼的脑、肝脏、脾脏和肾脏在血平板上进行分离培养,将分离培养的病原菌对卵形鲳鲹进行人工回归感染实验,试验鱼呈现自然发病症状:游泳异常、眼球突出且浑浊、鳍条基部充血,证明分离菌为卵形鲳鲹爆发性流行病的致病菌。通过形态学观察、生化鉴定、16S rRNA序列分析,结果表明,分离的致病菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae),暂定为中国湛江株GHZ007(GenBank:KX788919),其对卵形鲳鲹的LD50为2.42×106CFU/mL。药敏实验结果表明,分离菌株对四环素类和氨基糖苷类药物等17种试验药物敏感,对青霉素、复方新诺明等8种试验药物有耐药性。本研究将有助于为海豚链球菌病的防治提供理论基础。

关键词：卵形鲳鲹海豚链球菌 16S rRNA 药敏实验

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溶藻弧菌诱导凡纳滨对虾消减文库的构建及其表达序列标签分析

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水生生物学报 2010年第1期34卷 157-163页

作者：蔡小辉鲁义善吴灶和简纪常王蓓蔡双虎广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点试验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524025

利用抑制消减杂交技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)诱导的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴细胞cDNA文库。用DNAMAN5.2.2软件对560条高质量的ESTs进行聚类,共获得239个Unigenes。与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中66.9%为已知功能基因,33.1%为未知功能基因,GO分类将其分为7类,包括能量和基础代谢类相关的基因为第一大类占36%,免疫相关基因占15%,其他基因占8%,信号转导类占3%,抗氧化酶和凋亡相关蛋白均为2%,核蛋白类占1%。实验结果表明凡纳滨对虾在溶藻弧菌诱导下可产生一系列特异基因的表达,通过对文库的分析显示,基于PCR方法建立的SSH文库为取得大量免疫相关基因的ESTs序列提供了可能。

关键词：凡纳滨对虾溶藻弧菌抑制消减杂交(SSH) 表达序列标签(EST)

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徐闻方斑东风螺暴发性疾病病原分离鉴定以及防治手段探索

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基因组学与应用生物学 2016年第12期35卷 3401-3409页

作者：黄瑜汪志文周维蔡小辉张海艳鲁义善简纪常汤菊芬广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088

为了明确引起方斑东风螺急性死亡症的病原,对2015年6月广东省徐闻县发生的方斑东风螺(Babylonia areolata)急性死亡症进行了病原分离纯化,获得1株优势细菌,命名为XW-01。将XW-01人工感染方斑东风螺,表现出自然发病症状,证实分离菌株为... 详细信息

为了明确引起方斑东风螺急性死亡症的病原,对2015年6月广东省徐闻县发生的方斑东风螺(Babylonia areolata)急性死亡症进行了病原分离纯化,获得1株优势细菌,命名为XW-01。将XW-01人工感染方斑东风螺,表现出自然发病症状,证实分离菌株为致病菌。分离的菌株经形态学观察、生理生化鉴定和病原16S r RNA序列分析,结果显示该病原菌为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。XW-01对方斑东风螺半致死剂量(LD50)测定值为6.3×106 cfu/m L。药敏试验结果显示,该病原菌对常见的7种抗菌药物氟哌酸、氟苯尼考、氨苄西林、恩诺沙星、头孢三嗪、左旋氧氟沙星和妥布霉素敏感。添加不同剂量的三联生物噬菌王产品到水族箱中,对方斑东风螺用浸泡法进行人工感染哈维氏弧菌试验,观察东风螺发病及死亡情况。试验结果表明,添加1%的此产品可以明显降低东风螺的死亡率,表明三联生物噬菌王产品对东风螺感染哈维氏弧菌所引起的急性坏死病有明显的预防作用。

关键词：方斑东风螺急性死亡症哈维氏弧菌三联生物噬菌王

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南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达及其对大肠杆菌低温耐受性的增强作用

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水生生物学报 2013年第1期37卷 16-21页

作者：彭跃跃丁燏王金慧简纪常鲁义善刘莹广东海洋大学水产学院湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524025 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524025

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST,EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶,为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas ***-L)中的具体地位,采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析;并构建了原... 详细信息

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST,EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶,为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas ***-L)中的具体地位,采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析;并构建了原核表达载体pET28a(+)-GST,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过平板培养法探讨了重组菌*** BL21(pET28a(+)-GST)对低温胁迫的耐受性。结果显示,GST在0℃时表达量最高,最高可达对照组的两倍多;pET28a(+)-GST重组表达载体在*** BL21中实现了高效表达,且主要以包涵体形式存在,经HisTrap HP柱分离纯化获得高纯度的GST融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot分析得以验证;对低温胁迫实验发现南极衣藻GST蛋白的表达可以提高重组菌*** BL21对低温的耐受性,说明GST基因对南极衣藻适应南极低温环境具有重要作用。

关键词：南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶表达低温

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溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定

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生物技术通报 2021年第5期37卷 84-91页

作者：曾福源苏泽辉周诗慧谢妙庞欢瑛广东海洋大学深圳研究院深圳510000 广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAG... 详细信息

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化、琥珀酰化修饰。结果显示,pepck基因全长1 629 bp,重组菌株可以正确表达分子质量约60.9 kD的蛋白。诱导温度:在28℃条件下PEPCK存在于上清和包涵体中,在37℃则主要以包涵体形式存在;IPTG浓度:0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范围内,PEPCK的表达量无明显差异;时间:在0-8 h内PEPCK表达量随时间增长逐渐增加,诱导8 h后趋于稳定。Western blot显示PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。成功构建溶藻弧菌PEPCK重组表达菌株,其最优诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG,28℃诱导8 h;经鉴定PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。

关键词：溶藻弧菌 PEPCK蛋白原核表达乙酰化琥珀酰化

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凡纳滨对虾血清凝集素、溶血素的特性研究

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海洋科学 2006年第6期30卷 1-5页

作者：曹剑香简纪常吴灶和鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025

对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的血清凝集素和溶血素部分特性的研究结果表明，凡纳滨对虾血清凝集素热稳定性较差，温度高于50℃时，活性呈明显减弱至无活性，其最适温度为25～45℃；最适pH为8～9；盐度为24～48时，凝集活性最... 详细信息

对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的血清凝集素和溶血素部分特性的研究结果表明，凡纳滨对虾血清凝集素热稳定性较差，温度高于50℃时，活性呈明显减弱至无活性，其最适温度为25～45℃；最适pH为8～9；盐度为24～48时，凝集活性最强，当盐度超过48或者低于6时，凝集活性较差；凝集素活性能被浓度高于16mmol／L（包括16mmol／L）EDTA—Na2，D-葡萄糖，D-果糖及D-半乳糖完全抑制。Cu3^2＋使凝集素的活性完全丧失，而Ca^2＋和Mg^2＋能使凝集活性明显增强。45～60℃时，溶血素活性逐渐增强，60℃时达到最高；当pH6～9时，溶血素的活性较强；盐度为18～36时，能增强溶血素的活性；EDTA—Na2对溶血素的活性几乎无影响；Cu^2＋使溶血素丧失活性，Mg^2＋能增强溶血活性，Mn^2＋对溶血素的活性没看影响,而Ca^2＋知Ra^2＋时溶血素有轻微的抑制作用。

关键词：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 凝集素溶血素

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