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RNA干扰血管内皮钙黏蛋白表达对Ph＋急性淋巴细胞白血病细胞株Sup—B15甲磺酸伊马替尼敏感性的影响

中华血液学杂志 2013年第6期34卷 522-526页

作者：张焕新闫志凌宋旭光吕超曹江李振宇曾令宇陈翀徐开林徐州医学院附属医院血液科 221000 徐州医学院移植免疫实验室

目的探讨下调Ph＋急性淋巴细胞白血病细胞血管内皮钙黏蛋白（CD144）表达对甲磺酸伊马替尼敏感性的影响及可能的机制。方法通过慢病毒载体介导的RNA干扰（RNAi）沉默急性淋巴细胞白血病株Sup—B15细胞的CD144表达，建立CD144表达稳定下... 详细信息

目的探讨下调Ph＋急性淋巴细胞白血病细胞血管内皮钙黏蛋白（CD144）表达对甲磺酸伊马替尼敏感性的影响及可能的机制。方法通过慢病毒载体介导的RNA干扰（RNAi）沉默急性淋巴细胞白血病株Sup—B15细胞的CD144表达，建立CD144表达稳定下调的细胞株Sup—B15／shVEC。用CCK-8法检测甲磺酸伊马替尼对细胞增殖的影响；用AnnexinV／7一AAD标记，流式细胞术检测细胞凋亡；用流式细胞术检测CD34＋CD38-细胞比例变化；荧光定量PCR检测细胞ALDHImRNA水平；Westernb1ot法检测细胞CD144、CD133、Bcr—ab1、B—catenin表达水平。结果不同浓度甲磺酸伊马替尼对Sup—B15、Sup—B15／shVEC细胞均有增殖抑制作用，其半数抑制浓度（IC50值）分别为25．1、18．7txmo1／L，两组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）。20txmo1／L甲磺酸伊马替尼作用48h，Sup—B15及Sup—B15／shVEC细胞凋亡率分别为（3．03±0．72）％、（13．52±2．06）％，两组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞术检测结果显示Sup—B15细胞CD34＋CD38-细胞率明显高于Sup—B15／shVEC细胞[（2．39±0．28）％对（0．96±0．07）％]，两组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。Sup—B15／shVEC细胞与Sup—B15细胞相比，ALDH1转录水平明显下降（0．043±0．008对0．016±0．003），CD133蛋白、B—catenin总蛋白及核蛋白表达水平也明显下降，而bcr—ab1融合蛋白表达水平无明显变化。结论Sup—B15细胞CD144表达稳定下调后其对甲磺酸伊马替尼敏感性明显增高，该作用可能是通过降低p—catenin蛋白稳定性、减少p—catenin蛋白核转位实现的。

关键词： RNA干扰 Sup—B15细胞伊马替尼钙黏蛋白药物敏感性

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AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对U937细胞增殖、分化和凋亡的影响

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中华血液学杂志 2013年第2期34卷 153-156页

作者：吕超曹江孟凡静曾令宇陈翀吴庆运徐开林徐州医学院附属医院血液科 221002 徐州医学院移植免疫实验室

目的探讨单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）对急性单核细胞白血病细胞系U937细胞增殖、分化和凋亡的影响，并分析其可能的作用机制。方法用不同浓度AICAR处理U937细胞24、48h，用CCK-8法绘制... 详细信息

目的探讨单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）对急性单核细胞白血病细胞系U937细胞增殖、分化和凋亡的影响，并分析其可能的作用机制。方法用不同浓度AICAR处理U937细胞24、48h，用CCK-8法绘制细胞增殖曲线；以细胞形态学、AnnexinV／7-氨基放线菌素D（7-AAD）双标记等分析细胞凋亡情况；用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达。用实时定量PCR检测Bcl—xL、Bax、Bim、caspase-3mRNA表达的变化。结果AICAR对U937细胞增殖具有显著抑制作用，且作用呈时间和剂量依赖性，24、48h的半数抑制浓度（IC50）值分别为1．1和0．9mmoL／L。1．0mmol／LAICAR作用U937细胞24h，流式细胞术检测结果显示CDllb阳性细胞率无明显变化（P〉0．05），但细胞形态学出现典型的凋亡特征；AnnexinV／7-AAD标记的阳性细胞升高，细胞凋亡率为（6．81±1．16）％，高于对照组的（2．744-0．32）％（P〈0．05）。1．0mmol／LAICAR诱导U937细胞凋亡过程中Bcl—xL、Bax表达无明显变化，Bim、caspase-3表达显著增加（P〈0．05）。结论AICAR能有效抑制U937细胞增殖及促进细胞凋亡，但对U937细胞向髓系分化无明显影响，其促凋亡机制与上调Bim与caspase-3基因表达有关。

关键词：氨基咪唑类白血病细胞凋亡单磷酸腺苷激活的蛋白激酶 U937细胞

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靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

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中国实验血液学杂志 2013年第3期21卷 567-570页

作者：吕超曹江孟凡静曾令宇潘彬陈翀吴庆运宋旭光李振宇潘秀英徐开林徐州医学院移植免疫实验室江苏徐州221002 徐州医学院附属医院血液科

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编... 详细信息

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体(pSA-1、pSA-2、pSA-3)转染人白血病U937细胞系,G418(500 mg/L)有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降(P<0.05)。结论:成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。

关键词： AATF 短发夹RNA 白血病基因表达载体构建

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异基因骨髓移植并发移植物抗宿主病小鼠体内IL-22的细胞来源

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中国实验血液学杂志 2013年第6期21卷 1526-1529页

作者：赵恺黄栋赵冬梅陈翀吴庆运潘彬曾令宇李振宇徐开林徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002

本研究探讨小鼠经异基因骨髓移植后发生移植物抗宿主病(GVHD)时体内IL-22的细胞来源。分别以C57BL/6和BALB/c小鼠为供受鼠,受鼠经致死剂量全身照射后输注供鼠骨髓和脾淋巴细胞悬液,建立GVHD模型。实验分为正常组(normal)、单纯照射组(T... 详细信息

本研究探讨小鼠经异基因骨髓移植后发生移植物抗宿主病(GVHD)时体内IL-22的细胞来源。分别以C57BL/6和BALB/c小鼠为供受鼠,受鼠经致死剂量全身照射后输注供鼠骨髓和脾淋巴细胞悬液,建立GVHD模型。实验分为正常组(normal)、单纯照射组(TBI)、骨髓移植组(BMT)和骨髓联合脾细胞诱导GVHD组(BS)。ELISA法检测小鼠血浆中IL-22的水平;流式细胞术检测IL-22的细胞来源及所属亚群情况。结果表明,BS组小鼠血浆中IL-22水平最高,与正常小鼠相比差异有统计学意义(P<0.01);BS组小鼠脾、淋巴结和外周血中淋巴细胞均可产生IL-22,且IL-22+CD4+T细胞百分率高于IL-22+CD8+T细胞;除Th22细胞外,Th1细胞和Th17细胞也是GVHD小鼠体内IL-22的细胞来源,但以Th22细胞分泌IL-22为主。结论:GVHD小鼠体内可产生高水平的IL-22,其主要来源于IFN-γ-IL-17-IL-22+的Th22细胞。

关键词：骨髓移植移植物抗宿主病 T细胞白介素-22

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白血病干细胞的新型标志蛋白IL1RAP杂交瘤细胞的制备及其分泌单克隆抗体的检测

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中国实验血液学杂志 2013年第6期21卷 1390-1393页

作者：赵恺尹玲玲赵冬梅吴庆运陈翀潘彬曾令宇姚瑶徐开林徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002

本研究旨在制备针对白血病干细胞表面标志蛋白IL1RAP(IL-1 receptor accessory protein)的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。用重组人IL1RAP作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞经PEG融合,筛选... 详细信息

本研究旨在制备针对白血病干细胞表面标志蛋白IL1RAP(IL-1 receptor accessory protein)的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。用重组人IL1RAP作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株。分别应用ELISA和Western blot法对杂交瘤细胞上清中分泌抗体进行抗体类型、滴度和敏感性检测。分离人外周单个核细胞,检测所得抗体对细胞内源性抗原的特异性。结果表明,获得了8株可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为3H6E10、4B6A6、8G11B5、9E9F2、10D8A7、1C7H7、1D7G11和2D3D3;抗体类型鉴定为IgG1/κ型;分泌的单克隆抗体能特异性识别单个核细胞表达的IL1RAP。结论:本实验成功制备了可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞及其特异性的IL1RAP单克隆抗体,为将来有效清除体内白血病干细胞提供了新途径。

关键词： IL1RAP杂交瘤单克隆抗体白血病干细胞

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骨髓移植后肝静脉闭塞病模型的鉴定及机制探讨

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中华器官移植杂志 2013年第1期34卷 42-46页

作者：孙海英徐开林安立才齐昆明潘彬房婷化静刘迷迷曾令宇徐州医学院附属医院血液科、徐州医学院移植免疫实验室江苏221002

目的建立异基因骨髓移植后肝静脉闭塞病（HVOD）模型并探索其发生机制。方法将Balb／c小鼠随机分为3组，即生理盐水对照组（NS组）、单纯照射组和单纯骨髓移植组。于移植后第0、5、10、15和20天检测各组小鼠肝重、外周血胆红素总量（TBi... 详细信息

目的建立异基因骨髓移植后肝静脉闭塞病（HVOD）模型并探索其发生机制。方法将Balb／c小鼠随机分为3组，即生理盐水对照组（NS组）、单纯照射组和单纯骨髓移植组。于移植后第0、5、10、15和20天检测各组小鼠肝重、外周血胆红素总量（TBi1）以及外周血肿瘤坏死因子a（TNF-a）、白细胞介素6（IL-6）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）浓度的变化，小鼠肝脏组织病理学改变。结果小鼠肝重和TBi1均于骨髓移植后第5天开始升高，第15天达到高峰。骨髓移植第5、10天小鼠肝脏以充血、水肿变化为主，肝组织存在炎症细胞浸润；第15、20天小鼠肝脏充血、水肿及坏死减轻，以肝脏纤维化为主要表现，炎症浸润明显。单纯照射组小鼠照射后10d内全部死亡，肝脏充血、水肿严重。与NS组小鼠相比较，单纯骨髓移植组小鼠TNF-a、IL-6和MCP-1浓度明显升高。结论成功建立异基因骨髓移植后肝静脉闭塞病模型。肝静脉闭塞病的机制与全身照射后造成的肝脏内皮损伤、炎症细胞浸润及移植后细胞因子的变化密切相关。

关键词：造血干细胞移植内皮细胞肝静脉闭塞性疾病细胞因子类

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移植预处理后组织的冰冻切片制作方法

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江苏医药 2013年第3期39卷 269-271,F0002页

作者：化静房婷刘迷迷曾令宇徐州医学院附属医院血液病科移植免疫实验室江苏省221002

目的介绍一种移植预处理后组织的冰冻切片制作方法。方法予BALB/c小鼠清髓剂量(60 Co 7.5Gy全身照射)照射后4h内输入体外培养的含有绿色荧光蛋白(GFP)内皮祖细胞(EPC),分别于移植后6、12、24、36、48、72及96h取受鼠内脏组织制作冰冻切... 详细信息

目的介绍一种移植预处理后组织的冰冻切片制作方法。方法予BALB/c小鼠清髓剂量(60 Co 7.5Gy全身照射)照射后4h内输入体外培养的含有绿色荧光蛋白(GFP)内皮祖细胞(EPC),分别于移植后6、12、24、36、48、72及96h取受鼠内脏组织制作冰冻切片,用免疫荧光观察组织内GFP阳性细胞分布。结果荧光显微镜下可见肝、肺中GFP、大鼠抗小鼠泛内皮细胞单克隆抗体(MECA-32)阳性细胞,脾中见GFP、CD68阳性细胞;小肠中未发现明显GFP阳性、MECA-32阳性细胞。结论对移植预处理的组织进行及时恰当的处理后,荧光显微镜下可清晰地观察到组织形态结构变化及GFP阳性细胞分布。

关键词：移植预处理内皮祖细胞冰冻切片

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内皮祖细胞对BU／CY预处理小鼠骨髓移植后免疫重建的促进作用

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国际输血及血液学杂志 2013年第1期36卷 1-6页

作者：刘迷迷房婷化静付金玉黄玉金吴进燕徐开林曾令宇徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科江苏徐州221002

目的探讨异基因骨髓移植中联合内皮祖细胞（EPC）移植对接受白消安／环磷酰胺（Bu／CY）方案预处理小鼠移植后免疫重建的影响。方法选择周龄为8～10周龄，体重为（22～24）g的健康SPF级雄性BALB／c小鼠58只作为研究对象。随机分为正常... 详细信息

目的探讨异基因骨髓移植中联合内皮祖细胞（EPC）移植对接受白消安／环磷酰胺（Bu／CY）方案预处理小鼠移植后免疫重建的影响。方法选择周龄为8～10周龄，体重为（22～24）g的健康SPF级雄性BALB／c小鼠58只作为研究对象。随机分为正常对照组（n=9）：经尾静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）0．2mL；BU／CY预处理组（n=9）：移植前7d至前2d接受Bu／CY方案预处理后，经尾静脉注射PBS0．2mL；单纯骨髓细胞移植组（BMT组）（n=20）：BU／CY方案预处理后，经尾静脉注射供者骨髓细胞；EPC联合移植组（EPC组）（n=20）：BU／CY方案预处理后，经尾静脉注射供者骨髓细胞及EPC。于移植后第14，21，28天，采用流式细胞术检测各组小鼠骨髓中B系祖（ProB）细胞（CD19＋c-kit＋IgM-）数量、胸腺中CD4＋，CD8＋，双阳性（DP）及双阴性（DN）T淋巴细胞比例及脾脏中CD4＋，CD8＋T淋巴细胞及B淋巴细胞比例，并通过苏木素-伊红染色及免疫组化染色观察中枢和外周免疫器官组织结构的恢复及损伤血管内皮的修复情况。结果移植后BMT及EPC组小鼠骨髓中ProB细胞数量持续增高，第14天时，EPC组（0．83×10^6）显著高于BMT组（0．14×10^6）（χ2=7．2，P〈0．05）；胸腺中DP细胞比例于第21天达峰值，EPC组（0．58％）较BMT组（0．39％）显著增高（χ2=6．49，P〈0．05）；脾脏中CD4＋T细胞比例持续增高，第28天时，EPC组（3．64％）较BMT组（2．47％）显著增高（χ2=7．2，P〈0．05）；CD8＋T细胞比例在移植后第21天达峰值，EPC组（3．64％）较BMT组（3．21%）显著增高（χ2=5．42，P〈0．05）。组织病理学检查也显示EPC组小鼠的中枢及外周免疫器官组织结构恢复较BMT组快，组织中实质细胞数量恢复较BMT组快；对脾脏血窦内皮免疫组化染色的结果也显示，EPC组小鼠脾血窦内皮完整性的恢复较BMT组快。结论BU／CY预处理小鼠异基因骨髓移植中，联合EPC输注可促进移植受鼠免疫器官损伤血管内皮的修复、促进其组织结构的恢复，从而有效促进移植后的免疫重建。

关键词：骨髓移植内皮祖细胞免疫重建修复

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IL-22对移植物抗宿主病小鼠外周免疫器官功能的影响

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中国保健营养（中旬刊） 2013年第12期 50-51页

作者：赵恺赵冬梅尹玲玲徐开林徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科江苏徐州 221002 徐州医学院移植免疫实验室

目的：探讨IL-22对移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease, GVHD）小鼠的脾和肠系膜淋巴结功能的影响。方法：以C57BL/6和BALB/c小鼠为供受鼠建立GVHD模型后，随机分为GVHD+PBS组和GVHD+IL-22组。建模后第28天检测小鼠脾和肠系膜... 详细信息

目的：探讨IL-22对移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease, GVHD）小鼠的脾和肠系膜淋巴结功能的影响。方法：以C57BL/6和BALB/c小鼠为供受鼠建立GVHD模型后，随机分为GVHD+PBS组和GVHD+IL-22组。建模后第28天检测小鼠脾和肠系膜淋巴结总T细胞及其亚群数量，流式细胞术检测脾和淋巴结T细胞分泌IFN-γ的功能。结果：GVHD+IL-22组的脾和淋巴结T细胞总数均明显低于GVHD+PBS组，且GVHD+IL-22小鼠脾呈现坏死区。注射IL-22对脾CD4+T和CD8+T细胞分泌IFN-γ无影响，但可显著提高淋巴结IFN-γ+CD4+T细胞（Th1）和IFN-γ+CD8+T细胞（Tc1）的百分率。结论：虽然IL-22可降低GVHD小鼠外周T细胞数量但可部分增强外周T细胞分泌IFN-γ的能力。

关键词：白细胞介素-22 移植物抗宿主病 T细胞

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Th17细胞及Treg在急性移植物抗宿主病中的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2013年第5期36卷 426-428页

作者：赵冬梅(综述) 赵恺徐开林(审校) 徐州医学院移植免疫实验室徐州医学院附属医院血液科 221002

移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）的主要并发症。T细胞诱导和活化是GVHD发生的中心环节。辅助性T细胞（Th）17细胞及调节性T细胞（Treg）作为新近鉴定的T细胞亚群，两者之间存在相互调节关系，并且在GVHD中... 详细信息

移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）的主要并发症。T细胞诱导和活化是GVHD发生的中心环节。辅助性T细胞（Th）17细胞及调节性T细胞（Treg）作为新近鉴定的T细胞亚群，两者之间存在相互调节关系，并且在GVHD中发挥了重要作用。笔者现就近年来Th17细胞和Treg细胞及两者在aGHVD中相互调节作用的研究进展作一综述。

关键词：移植物抗宿主病 Th17细胞 T淋巴细胞，调节

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