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眼科新进展 2011年第12期31卷 1133-1136页

作者：王新法徐锦堂暨南大学附属第一医院眼科广东省广州市510632 暨南大学医学院眼科研究室广东省广州市510632

目的观察富血小板血浆对体外培养猫角膜内皮细胞增殖的影响。方法采用揭膜法与消化法相结合获取猫角膜原代内皮细胞,培养基采用DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)。采用二次离心法提取富血小板血浆。在完全培养基中加入体积分数分别为5... 详细信息

目的观察富血小板血浆对体外培养猫角膜内皮细胞增殖的影响。方法采用揭膜法与消化法相结合获取猫角膜原代内皮细胞,培养基采用DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)。采用二次离心法提取富血小板血浆。在完全培养基中加入体积分数分别为5%、10%、20%的富血小板血浆培养角膜内皮细胞,以未加入富血小板血浆的完全培养基为对照。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,扫描电镜观察细胞形态变化。结果富血小板血浆体外培养角膜内皮细胞时间越长,其促增殖作用越明显,与对照组比较差异均有显著统计学意义意义(均为P<0.01),且随着富血小板血浆含量的增加,角膜内皮细胞增殖越明显,呈剂量依赖性。扫描电镜检测表明,与对照组相比,PRP作用组角膜内皮细胞表面可见丰富的微绒毛,且随着富血小板血浆含量的增加,微绒毛越丰富。结论富血小板血浆能明显促进体外培养猫角膜内皮细胞增殖。

关键词：富血小板血浆猫角膜内皮细胞细胞培养细胞增殖

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脐带间充质干细胞对角膜内皮细胞增殖能力的影响

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实用医学杂志 2011年第1期27卷 7-10页

作者：丁姗姗吴静孙国栋侯光辉陈剑徐锦堂暨南大学附属第一医院眼科广州市510632 暨南大学医学院眼科研究室广州市510632 暨南大学附属第一医院骨科广州市510632 广东省珠海市人民医院眼科 519000

目的:探讨并优化人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;观察兔角膜内皮细胞(cornea endothelial cells,CEC)与hUCMSCs共培养后增殖能力及细胞周期的变化。方法:用... 详细信息

目的:探讨并优化人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;观察兔角膜内皮细胞(cornea endothelial cells,CEC)与hUCMSCs共培养后增殖能力及细胞周期的变化。方法:用酶消化法体外分离培养hUCMSCs,流式细胞仪检测hUCMSCs免疫表型;将CEC分别与hUCMSCs、兔角膜基质细胞在Transwell体系中共培养,通过流式细胞术观察内皮细胞增殖能力及细胞周期的变化。结果:采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs。接种24h,贴壁细胞形态多为长梭形、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一。流式细胞仪分析第3代细胞均表达CD29、CD44、CD105,不表达造血干细胞标记CD34、CD45和HLA-DR。与空白对照组CEC周期比较脐带间充质干细胞组与基质细胞组角膜内皮细胞S期细胞比例增加,G1期细胞比例下降,干细胞组增加幅度高于基质细胞组。干细胞组角膜内皮细胞S期细胞比例比空白对照组的平均增加近17%,增殖能力显著提高。结论:经鉴定用酶消化法体外能成功分离培养出hUCMSCs,将其与CEC共培养能促进CEC增殖。

关键词：间质干细胞角膜内皮细胞共培养细胞增殖

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Maxadilan对诱导多能干细胞增殖的作用

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中国病理生理杂志 2011年第10期27卷 1982-1988页

作者：招志毅陈建苏余榕捷刘晓飞谭美华李红阳暨南大学附属第一医院眼科医学院眼科研究所再生医学教育部重点实验室广东广州510632 暨南大学生物工程研究所广东广州510632

目的:探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的PAC1受体特异激动剂maxadilan对人诱导多能干细胞(IPSCs)增殖的作用。方法:培养人IPSCs,利用RT-PCR和Western blotting检测IPSCs的PAC1受体;IP-SCs培养基中加入不同浓度的maxadilan作为实验组... 详细信息

目的:探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的PAC1受体特异激动剂maxadilan对人诱导多能干细胞(IPSCs)增殖的作用。方法:培养人IPSCs,利用RT-PCR和Western blotting检测IPSCs的PAC1受体;IP-SCs培养基中加入不同浓度的maxadilan作为实验组,未加入maxadilan作为对照组。CCK-8法检测maxadilan对IPSCs增殖的影响;流式细胞仪分析maxadilan对细胞周期的影响;染色体核型分析检测maxadilan对IPSCs核型的影响;real-time-qPCR和免疫荧光法从基因及蛋白水平检测maxadilan对IPSCs的多能性基因Nanog和OCT4的影响;real-time qPCR检测maxadilan对IPSCs及其形成胚体细胞的Nestin和PAX6基因的影响;RT-PCR检测maxadilan对IPSCs分化为三胚层能力的影响。结果:RT-PCR和Western blotting均显示IPSCs含有PAC1受体;CCK-8法显示100 nmol/L maxadilan组比对照组细胞增多16%(P<0.05);流式细胞仪分析显示孵育100 nmol/Lmaxadilan 3 h、6 h和9 h后IPSCs增殖指数为47.23%、59.70%、55.67%,与对照组37.00%相比,差异显著(P<0.05);染色体核型分析显示maxadilan处理过的IPSCs核型正常;RT-PCR、real-time qPCR和免疫荧光法显示maxadilan未影响IPSCs多能性。结论:人IPSCs存在PAC1受体,maxadilan对人IPSCs具有促进细胞增殖作用且没有影响IPSCs的多能性和染色体核型。

关键词： Maxadilan 诱导多能干细胞细胞增殖染色体核型分析

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Maxadilan 对兔角膜上皮细胞的促增殖作用

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眼科新进展 2011年第10期31卷 901-903,911页

作者：招志毅陈建苏余榕捷谭美华李红阳刘晓飞王静静暨南大学附属第一医院眼科暨南大学医学院眼科研究所再生医学教育部重点实验室广东省广州市510632 暨南大学生物医学工程研究所广东省广州市510632

目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的PAC1受体特异激动剂Maxadilan对角膜上皮细胞的促增殖作用。方法分离新西兰大白兔角膜上皮细胞,并在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基... 详细信息

目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的PAC1受体特异激动剂Maxadilan对角膜上皮细胞的促增殖作用。方法分离新西兰大白兔角膜上皮细胞,并在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔角膜上皮细胞PACAP的PAC1受体;细胞增殖实验采用CCK-8法检测,角膜上皮细胞培养基中分别加入0.01μmol.L-1、0.03μmol.L-1、0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan作为实验组,未加入Maxadilan作为对照组,检测不同浓度的Maxadilan对角膜上皮细胞增殖的影响;流式细胞仪分析0.10μmol.L-1Maxadilan对细胞周期的影响。结果 RT-PCR检测显示兔角膜上皮细胞含有PACAP的PAC1受体;CCK-8法检测显示0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan实验组分别比对照组细胞增多29.1%、41.5%、32.5%,与对照组相比差异有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000);流式细胞仪分析显示0.10欁μmol.L-1Maxadilan组细胞增殖指数平均值为35.98%,与对照组细胞细胞增殖指数平均值29.48%相比,差异有统计学意义(P=0.014)。结论角膜上皮细胞存在PACAP的PAC1受体,Maxadilan对角膜上皮细胞有促增殖作用。

关键词： Maxadilan 角膜上皮细胞细胞增殖兔

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人羊膜上皮细胞的干细胞特性

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第19期15卷 3555-3558页

作者：金玲陈剑吴静徐锦堂周清刘小勇深圳市宝安区人民医院广东省深圳市518101 暨南大学附属第一医院眼科广东省广州市510630 暨南大学医学院眼科研究室广东省广州市510630

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏... 详细信息

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。

关键词：人羊膜上皮细胞细胞培养胚胎干细胞 OCT-4 CD29 CD34

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碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖的影响

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热带医学杂志 2011年第5期11卷 543-545页

作者：高松哲陈剑王彦平肖盼宋子宣阮余霞杨筱曦吴静唐光霞暨南大学附属第一医院眼科广东广州510632 暨南大学医学院病理生理学系广东广州510632 暨南大学医学院眼科研究室广东广州510632

目的观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)增殖的影响,以探索体外培养HAMSCs的最适条件。方法分离、培养HAMSCs,选取第3代细胞进行鉴定及检测。实验组将bFGF分为0.1、0.5、1、5、10、20、40、... 详细信息

目的观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)增殖的影响,以探索体外培养HAMSCs的最适条件。方法分离、培养HAMSCs,选取第3代细胞进行鉴定及检测。实验组将bFGF分为0.1、0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml共8个浓度组;阴性对照组只加HAMSCs,不加bFGF;空白对照组只加培养基。各组孵育48h后加入Am-Blue试剂,继续孵育,待培养基由靛青蓝色开始变成粉红色时取出用酶标仪测量各组的吸光度(OD),重复3次实验。结果 0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml浓度组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与0.5、1、5ng/ml组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与40、80ng/ml组相比,差异无统计学意义(P=0.067),表明bFGF促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。结论 bFGF能够促进HAMSCs增殖,且促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。

关键词：羊膜间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子增殖力 Am-Blue

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TGF-β在角膜中的作用

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眼科新进展 2011年第4期31卷 301-304页

作者：徐锦堂吴静潘红卫胡琦暨南大学医学院眼科研究室广东省广州市510630 哈尔滨医科大学第一临床医学院眼科医院黑龙江省哈尔滨市150001

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一个多功能的生长因子,对角膜上皮、内皮和基质细胞均有影响。TGF-β与免疫抑制有着密切的联系,当在培养液内添加TGF-β1时,可使CD69+CD25+和CD25+CD4+、CD25+CD8+、CD71+CD4+... 详细信息

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一个多功能的生长因子,对角膜上皮、内皮和基质细胞均有影响。TGF-β与免疫抑制有着密切的联系,当在培养液内添加TGF-β1时,可使CD69+CD25+和CD25+CD4+、CD25+CD8+、CD71+CD4+、CD71+CD8+的表达受到抑制。有实验证明:局部应用TGF-β1对大鼠的移植排斥反应具有抑制作用,TGF-β1治疗组移植片比对照组透明时间长。用猪角膜作载体,体外构建TGF-β1转基因后板层角膜植片移植给兔,结果表明:角膜内皮细胞内高表达TGF-β1,可抑制免疫排斥反应的发生和延长移植片的成活时间。初步应用TGF-β1滴眼液治疗角膜与免疫相关疾病结果证实,TGF-β1能够提高这些眼病的治愈率,缩短其病程。

关键词：转化生长因子-β1 角膜移植排斥

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第十六次全国眼科年会图片展获奖作品选登

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中华眼科医学杂志（电子版） 2011年第1期1卷 114-115页

作者：卿国平李婷蔡正元王桂芳戴荣平高磊吕刚王怀洲张赫杜虹首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心 100730 新疆维吾尔自治区人民医院眼科上海市第一人民医院眼科研究所暨南大学附属第一医院眼科北京协和医院眼科青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院眼科长春一诺眼科医院英智眼科医院检查室

本文图片选自于中华医学会第十六次全国眼科学术会议期间,第十一届眼科图片展获得专家评审团特别推荐奖的优秀作品.图片简介 ①晶状体悬韧带,卿国平;②黄斑裂孔,李婷;③赤道部视网膜裂孔,蔡正元;④'沟回',王桂芳;⑤'庆典... 详细信息

本文图片选自于中华医学会第十六次全国眼科学术会议期间,第十一届眼科图片展获得专家评审团特别推荐奖的优秀作品.图片简介 ①晶状体悬韧带,卿国平;②黄斑裂孔,李婷;③赤道部视网膜裂孔,蔡正元;④'沟回',王桂芳;⑤'庆典',王桂芳;⑥'青蛙',戴荣平;⑦视网膜前出血,高磊;⑧视网膜皱襞,吕刚;⑨瞳孔残膜,王怀洲;⑩'君为谁舞?',张赫; '群星拱日',杜虹; BOWEN。

关键词：视网膜前出血黄斑裂孔晶状体悬韧带王桂芳获奖作品选张赫学术会议专家评审团中华医学会赤道部

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不同消化分离方法分离人羊膜间充质干细胞效果比较

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中国病理生理杂志 2010年第5期26卷 1033-1037页

作者：肖盼陈剑王彦平吴静郭娴吟杨筱曦刘小勇暨南大学附属第一医院眼科广东广州510632 暨南大学医学院病理生理学系广东广州510632 暨南大学医学院眼科研究室广东广州510632

目的:比较不同消化分离方法提取人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)的分离效果,以供选择一种更有效的分离方法。方法:将新鲜羊膜组织分成4片6cm×6cm大小的组织块,采用4种不同方法进行消化分离:第1组:先刮除+胶原酶Ⅱ组;第2组:先刮除+胶原... 详细信息

目的:比较不同消化分离方法提取人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)的分离效果,以供选择一种更有效的分离方法。方法:将新鲜羊膜组织分成4片6cm×6cm大小的组织块,采用4种不同方法进行消化分离:第1组:先刮除+胶原酶Ⅱ组;第2组:先刮除+胶原酶Ⅳ组;第3组:先剪碎+胶原酶Ⅱ组;第4组:先剪碎+胶原酶Ⅳ组。对这4组原代培养HAMSCs进行存活数、形态学观察比较,第3代HAMSCs抗原检测及成脂成骨诱导分化实验。结果:第1组和第2组的HAMSCs存活数高于第3组和第4组(P<0.05)。第1组和第2组的HAMSCs成份较第3组和第4组纯净,后2组夹杂着一些团状的人羊膜上皮细胞(HAECs)。抗原结果显示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105表达阳性,CD31、CD34、CD45、HLA-DR表达阴性,Vimentin、SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、telom-erase结果阳性。成脂成骨诱导分化实验成功。结论:通过先将人羊膜用胰蛋白酶+EDTA消化液消化后,再将HAECs刮除干净,然后剪碎再用胶原酶消化的改进方法对HAMSCs保护较好,较易提取,获取细胞量和纯度均较传统方法高。胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅳ2种消化酶对HAMSCs的提取影响不大。

关键词：羊膜间充质干细胞细胞分离

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有序排列微模板培养角膜基质细胞及其细胞生物学变化

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眼科研究 2010年第8期28卷 699-702页

作者：田振彩陈建苏周平李沁华李晓霞戴静赵秀丽暨南大学附属第一医院眼科暨南大学医学院眼科研究室再生医学教育部重点实验室广州510632 暨南大学生物医学工程系广州510632

目的探讨CO2激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。方法用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组... 详细信息

目的探讨CO2激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。方法用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组,平板组作为对照组。将角膜基质细胞悬液以1×105/mL细胞密度接种于培养板中,倒置显微镜下观察细胞生长情况,苏木精-伊红染色观察细胞排列的形态学差异,免疫荧光法检测培养板上细胞的波形蛋白,实时监测显微镜下观察24h窄间隔组细胞的接触指引特性及细胞的动态生长过程。结果培养第1天倒置显微镜下见3组培养细胞贴壁生长状态无明显区别,窄间隔组和宽间隔组细胞逐渐围绕沟槽接触指引生长,表现为有序排列,且窄间隔组较宽间隔组明显。苏木精-伊红染色和免疫荧光染色显示培养的细胞在窄间隔组沟槽的接触指引下呈有序排列,呈现10余层细胞排列的平行板层结构。3组细胞波形蛋白免疫荧光染色均呈阳性反应。实时监测显微镜下可见窄间隔组细胞体部首先贴壁,在接触指引下生长,而细胞在干燥环境下的凋亡始于细胞伪足突起处。结论利用CO2激光打标机制备的有序排列微模板可获得有序排列的角膜基质细胞,有利于在接近生理状态条件下角膜基质层的构建。

关键词：角膜基质细胞有序排列细胞培养微纹理细胞生物学

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