检索结果-内蒙古大学图书馆

可溶性HLA-A~*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

中国生物工程杂志 2006年第9期26卷 5-10页

作者：贾仟涛徐丽慧迟晓云查庆兵李丰耀何贤辉暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心

目的：构建HLA—A＊0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的融合蛋白CHLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA—A28供者外周血单个核细胞（PBMC）中克隆HLA-A＊0203重链基因... 详细信息

目的：构建HLA—A＊0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的融合蛋白CHLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA—A28供者外周血单个核细胞（PBMC）中克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，并测序鉴定，然后以PCR方法构建HLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示，从3名HLA-A2＊供者PBMC中克隆的cDNA中，只有从供者2获得编码HLA-A＊0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21（ED3）中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％；产物相对分子质量约为34kDa，与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，为制备HLA-A＊0203四聚体打下基础。

关键词：人类白细胞抗原胞外域融合蛋白原核表达包涵体

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胸腺细胞和细胞器水平的线粒体膜电势研究

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分子细胞生物学报 2006年第2期39卷 132-138页

作者：王通曾耀英邢飞跃梁佩燕梁兆端贺芳暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广州510630

以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡；利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡；利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化：抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况... 详细信息

以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡；利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡；利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化：抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况。实验结果显示,DEX显著诱导胸腺细胞早期和晚期凋亡,凋亡细胞主要来自G_0/G_1期；细胞水平可见DEX介导与△ψm相关的J-aggregate和DiOC_6(3)可染性降低,同时介导线粒体数量显著降低,6h细胞膜完整性无显著变化：单纯线粒体检测结果显示,多数线粒体维持正常△ψm。提示,DEX介导胸腺细胞凋亡中线粒体数量降低,现存线粒体多保持着正常△ψm以维持凋亡过程细胞能量供给。

关键词：凋亡细胞水平线粒体膜电势单纯线粒体功能

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HLA-A2^+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第2期22卷 247-251页

作者：查庆兵何贤辉徐丽慧迟晓云曾耀英暨南大学组织移植与免疫中心教育部重点实验室广东广州510632

目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2+供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以... 详细信息

目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2+供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记,流式细胞术分析染色结果,寻找四聚体最佳染色条件,并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达。结果:以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC。A2-NLV四聚体用量为0.3μg时,与100μL全血于4℃温育1h,特异性染色效果最佳,而与CD8-T细胞非特异性结合很低。以此优化条件进行特异性CTL表型分析,结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低,表达CD57的百分率较非特异性CTL高,CD25分子只表达于活化的特异性CTL上。结论:通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性,降低非特异性结合,优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析。

关键词： HLA-A2四聚体巨细胞病毒 CTL 四聚体染色

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分泌型PD-L1真核表达载体的构建、表达及其体外效应的初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第11期26卷 1009-1012页

作者：胡萍季煜华李君武林绍强韦静李小兰黄泽棋暨南大学医学院微生物和免疫学教研室广州510632 暨南大学组织移植与免疫中心

目的构建分泌型PD-L1真核表达载体,并对其生物学活性进行初步研究。方法以RT-PCR方法从孕鼠胎盘中获得程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)配体PD-L1的胞外段基因片段,定向连接于pcDNA3．1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1；用脂质... 详细信息

目的构建分泌型PD-L1真核表达载体,并对其生物学活性进行初步研究。方法以RT-PCR方法从孕鼠胎盘中获得程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)配体PD-L1的胞外段基因片段,定向连接于pcDNA3．1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1；用脂质体将重组子导入NIT细胞,转染后的NIT命名为NITp。以Western blot鉴定重组蛋白的表达。MTT比色法检测NITp细胞培养上清对同种混合淋巴细胞培养反应的影响；用ELISA试剂盒检测NITp细胞培养上清对反应性T细胞分泌的细胞因子的影响。结果RT-PCR得到约730bp目的基因片段,测序结果显示该目的基因与Gen- Bank上的序列相符；Western blot分析提示NITp分泌性表达目的蛋白；NITp培养上清可抑制混合淋巴细胞增殖,其效应呈剂量依赖性；反应性T细胞分泌的细胞因子检测结果显示,培养上清中IL-4、IFN-γ、IL-2水平降低,与正常对照组差异有统计学意义。结论成功构建PD-L1基因真核表达载体pcDNA-PDL1,PD-L1蛋白对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,并可在一定程度上抑制特异性T细胞的活化。

关键词： PD-L1 混合淋巴细胞培养细胞因子 1型糖尿病

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NOD/SCID小鼠胎盘细胞内细胞因子表达及其与妊娠转归的关系

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中国病理生理杂志 2006年第3期22卷 563-566页

作者：贺芳曾耀英林羿陈艺菁罗文亭王通暨南大学组织移植与免疫研究中心广东广州510632

目的:研究Th1和Th2型细胞因子在胎盘淋巴细胞内的表达状况及其与NOD/SCID孕鼠妊娠转归的关系。方法:比较BALB/c和NOD/SCID小鼠孕13.5d胚胎吸收率(RR),采用4色流式细胞术检测胎盘淋巴细胞内Th1型(TNF-α和IL-2)和Th2型(IL-10)细胞因子表... 详细信息

目的:研究Th1和Th2型细胞因子在胎盘淋巴细胞内的表达状况及其与NOD/SCID孕鼠妊娠转归的关系。方法:比较BALB/c和NOD/SCID小鼠孕13.5d胚胎吸收率(RR),采用4色流式细胞术检测胎盘淋巴细胞内Th1型(TNF-α和IL-2)和Th2型(IL-10)细胞因子表达率。结果:虽然NOD/SCID小鼠存在多重免疫缺陷,但BALB/c和NOD/SCID小鼠孕13.5dRR无显著差异;NOD/SCID×NOD/SCID母-胎界面CD8+IL-10+/CD8+细胞百分率显著高于BALB/c×BALB/c妊娠模型(P<0.01),而CD4和CD8阳性细胞内TNF-α和IL-2表达水平均无显著差异。结论:母-胎界面CD8+IL-10+/CD8+细胞百分率自发性升高可能与NOD/SCID小鼠基本正常的生育力有关。

关键词：胎盘细胞因子类免疫缺陷妊娠结局

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NO介导的小鼠胸腺细胞中线粒体的变化在细胞凋亡过程中的作用

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第3期22卷 302-305页

作者：王通曾耀英邢飞跃贺芳王炯坤暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510630

目的：研究一氧化氮（NO）介导的胸腺细胞凋亡中线粒体膜电位（△ψm）和心磷脂（CL）含量变化的特点.方法：以S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）作为NO的供体诱导胸腺细胞凋亡,以地塞米松（DEX）作为阳性对照药物;设空白对照组、SNAP组和... 详细信息

目的：研究一氧化氮（NO）介导的胸腺细胞凋亡中线粒体膜电位（△ψm）和心磷脂（CL）含量变化的特点.方法：以S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）作为NO的供体诱导胸腺细胞凋亡,以地塞米松（DEX）作为阳性对照药物;设空白对照组、SNAP组和DEX组3个实验组;经膜联蛋白Ⅴ（annexinⅤ mAb）和碘化丙啶（PI）染色后,用流式细胞术（FCM）检测细胞磷脂酰丝氨酸（PS）外翻;用3,3＇-二已基噁羰花青碘化物[DiOC6（3）]和PE-anti-annexin Ⅴ mAb检测凋亡中△ψm变化;用壬基吖啶橙（NAO）和PE-anti-annexin Ⅴ mAb检测凋亡中线粒体CL变化.结果：SNAP作用后6 h,胸腺细胞出现典型的细胞凋亡特征,多数annexin Ⅴ阳性的细胞出现皱缩.DEX组△ψm降低且未凋亡的细胞比例显著高于空白对照组（P＜0.01）;而SNAP组该群细胞所占比例与空白对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.各组中约40%～50%的DiOC6（3）阴性细胞同正常细胞的大小.SNAP组CL含量降低的凋亡细胞所占比例显著高于对照组（P＜0.01）,未见CL含量降低且未凋亡的细胞群.空白对照组和SNAP组中分别有（48.32±3.96）%、（43.64±4.90）%的细胞CL含量降低但大小同正常细胞.结论：NO介导的小鼠胸腺细胞的凋亡过程,依次为磷脂酰丝氨酸外翻、线粒体去极化、CL氧化及细胞皱缩.同DEX模型组相比较,NO介导的小鼠胸腺细胞线粒体的变化为凋亡过程中较晚期的变化.

关键词：一氧化氮 S-亚硝基-N-乙酰青霉胺线粒体凋亡

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地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量的变化

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中国药理学通报 2006年第5期22卷 563-567页

作者：王通曾耀英邢飞跃梁佩燕暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510630

目的研究地塞米松(DEX)诱导的小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量变化。方法分别设对照组(Control)和DEX组;在6 h,分别以NAO和M itotracker G reen(MG)单染流式细胞术检测线粒体质量变化,以D iOC6(3)染色流式细胞术检测线粒体膜电势变化,以An... 详细信息

目的研究地塞米松(DEX)诱导的小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量变化。方法分别设对照组(Control)和DEX组;在6 h,分别以NAO和M itotracker G reen(MG)单染流式细胞术检测线粒体质量变化,以D iOC6(3)染色流式细胞术检测线粒体膜电势变化,以Annexin V-PE/MG双染流式细胞术检测细胞凋亡中线粒体质量改变特点。结果NAO染色检测结果显示终浓度1μmol.L-1DEX可以诱导小鼠胸腺细胞线粒体心磷脂含量降低,与对照组比较P<0.01;MG染色流式细胞术结果表明DEX(P<0.01)诱导了胸腺细胞线粒体质量的降低;DEX(P<0.01)诱导线粒体膜电势依赖性D iOC6(3)在胸腺细胞中可染性下降;Annexin V-PE/MG双染流式细胞术显示,凋亡细胞中存在一定比例的低线粒体质量细胞,DEX组该群细胞多于对照组(P<0.01)。结论DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量降低;线粒体质量评价在细胞凋亡相关药理学研究领域有应用前景。

关键词：胸腺细胞凋亡线粒体质量 NAO Mitotracker Green

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染料木黄酮对生长板软骨细胞胶原合成的影响及其机制

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中国药理学通报 2006年第8期22卷 927-929页

作者：季煜华曾耀英俞瑜暨南大学组织移植与免疫研究中心教育部重点实验室广东广州510632

目的探讨染料木黄酮(5,7,4′三羟基异黄酮)对大鼠肋生长板软骨细胞(ratcostochondralgrowthplatechondrocyte,RGC)胶原和Sox9表达的影响。方法原代培养RGC,3Hproline参入、RTPCR和Westernblot分别检测染料木黄酮对第1代RGC胶原合成、col2a1基因转录和Sox9表达的影响。结果染料木黄酮抑制RGC的胶原合成(P<0.05),col2a1的转录和Sox9的表达,其抑制作用随着浓度的升高而增强。结论染料木黄酮抑制培养RGC胶原合成的作用至少部分是通过下调Sox9的表达实现的。

关键词：染料木黄酮生长板软骨细胞 Ⅱ型胶原 Sox9

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p38丝裂原活化蛋白激酶在小鼠T细胞增殖中的作用

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2006年第4期27卷 515-518,525页

作者：于哲邢飞跃王通周建国曾耀英暨南大学组织移植与免疫中心广东广州510632

目的:了解p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在ConA刺激下小鼠T细胞增殖中的作用。方法:以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色,建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)刺激下评价小鼠T细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析p38丝裂原活... 详细信息

目的:了解p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在ConA刺激下小鼠T细胞增殖中的作用。方法:以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色,建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)刺激下评价小鼠T细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂SB203580在不同剂量、不同时间对T细胞增殖的作用,并应用CellQuest和SPSS10.0 forW indows软件分析增殖细胞各代所占比例和增殖指数(PI)。结果:羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色分析显示,随着SB203580浓度从0.5μmol/L逐渐增至15.0μmol/L,T细胞增殖逐渐减弱,以15.0μmol/L SB203580的抑制作用最为明显,呈剂量依赖关系(r=-0.97,P<0.01);SB203580浓度增加至20.0μmol/L时,细胞大量死亡。选用SB203580最佳浓度(15.0μmol/L),随时间从24 h至72 h递增,SB203580对T细胞增殖的抑制作用逐渐增强,以72 h抑制作用最为明显,84~96 h后,抑制作用逐渐减弱。结论:p38 MAPK在ConA刺激的T细胞增殖中起着重要的作用。

关键词： p38丝裂原活化蛋白激酶 T淋巴细胞增殖小鼠

来源：评论

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白杨素对小鼠T细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2006年第6期27卷 779-783页

作者：赵令斋曾耀英曾祥凤林长乐黄秀艳王通肇静娴暨南大学组织移植与免疫中心广东广州510632

目的:研究白杨素(CR)对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响,初步探讨其免疫调节作用机制。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测小鼠活化T细胞CD69的表达情况;用羧基荧光素已酰已酸(CFDA-... 详细信息

目的:研究白杨素(CR)对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响,初步探讨其免疫调节作用机制。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测小鼠活化T细胞CD69的表达情况;用羧基荧光素已酰已酸(CFDA-SE)染色结合流式细胞术,分析T细胞增殖相关指数;用碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期分布。结果:加入终浓度为5、25、50μmol/L的CR后,活化T细胞CD69的表达率由ConA对照组的(85.12±1.07)%,分别降低为(78.42±1.82)%、(66.24±1.43)%和(53.09±1.77)%;72 h的T细胞增殖指数由ConA对照组的2.29±0.14分别降至1.91±0.02、1.47±0.03和1.14±0.01;对细胞周期的影响表现为:随着CR浓度升高,处于G0/G1期的细胞增加,S期细胞减少,25μmol/L时,G2/M期细胞也减少。结论:CR能有效抑制小鼠T细胞的体外活化和增殖,阻滞活化细胞从G1期进入S期,是一种潜在的免疫抑制剂。

关键词：白杨素 CD69 细胞增殖细胞周期流式细胞术

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