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HBsAg重组腺病毒转染的树突状细胞诱导BALB／c小鼠抗HBV免疫的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2006年第6期26卷 553-559页

作者：黄茵陈智贾红宇吴伟蔡玲斐周承浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部传染病重点实验室 310018 杭州师范学院基础医学部杭州师范学院基础医学部免疫学教研室

目的研究HBsAg重组腺病毒转染的小鼠树突状细胞(DC)体内外免疫刺激活性和诱导小鼠抗HBV免疫的特点。方法BALB／c小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC,转染HBsAg重组腺病毒Ad-S或被HBsAg蛋白冲击后,流式细胞术分析DC的表型,混合淋巴细胞反应(MLR... 详细信息

目的研究HBsAg重组腺病毒转染的小鼠树突状细胞(DC)体内外免疫刺激活性和诱导小鼠抗HBV免疫的特点。方法BALB／c小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC,转染HBsAg重组腺病毒Ad-S或被HBsAg蛋白冲击后,流式细胞术分析DC的表型,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC的刺激活性;或与pcDNA3．1(+)-S质粒分别免疫小鼠后,LDH法测定脾细胞CTL活性,放免法检测血清抗- HBs;流式细胞术分析体外自体MLR中及免疫后小鼠脾脏T细胞内细胞因子。结果DC／Ad-S、DC／HBsAg和各对照组DC之间的表型和MLR差异无统计学意义,并均刺激TH和Tc分泌IFN-γ。DC／Ad-S免疫后2周能诱导比DNA疫苗更强产生IFN-γ的TH(P<0．05),以及比DC／HBsAg和DNA疫苗更强分泌IFN-γ的Tc(均P<0．01)和特异性CTL(P<0．05,P<0．01)。但DC／Ad-S和DC/HBsAg诱导的CTL反应及Tc分泌IFN-γ在免疫后4周均明显减弱,且诱导抗-HBs作用弱于DNA疫苗。结论HBsAg重组腺病毒转染的DC比HBsAg冲击的DC及DNA疫苗能诱导更强的TH1／Tc1(Ⅰ型)细胞免疫和特异性CTL反应,是诱导抗HBV细胞免疫的有效刺激细胞。

关键词：乙肝表面抗原树突状细胞腺病毒 Ⅰ型免疫应答细胞毒性T淋巴细胞

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HBSAg基因修饰的树突状细胞诱导HBV转基因小鼠的免疫应答

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中华传染病杂志 2006年第5期24卷 306-310页

作者：黄茵陈智贾红宇吴炜蔡玲斐周承浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部传染病重点实验室杭州310003 杭州师范学院基础医学部杭州师范学院基础医学部免疫学教研室

目的探讨HBsAg重组腺病毒Ad-S转染的小鼠树突状细胞(DC)诱导HBV转基因(Tg)小鼠免疫应答的作用特点及其可能的治疗作用。方法Tg小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC,转染Ad-S或被HBsAg蛋白冲击后,与pcDNA3．1(+)-S质粒分别免疫Tg鼠,用流式细胞术... 详细信息

目的探讨HBsAg重组腺病毒Ad-S转染的小鼠树突状细胞(DC)诱导HBV转基因(Tg)小鼠免疫应答的作用特点及其可能的治疗作用。方法Tg小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC,转染Ad-S或被HBsAg蛋白冲击后,与pcDNA3．1(+)-S质粒分别免疫Tg鼠,用流式细胞术、乳酸脱氢酶释放法、酶联免疫分析(ELISA)、荧光定量聚合酶链反应(PCR)等分别检测脾脏T细胞内细胞因子和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性、血清HBsAg、抗-HBs、HBV DNA及丙氨酸转氨酶(ALT)水平；病理和免疫组化分析肝脏组织学及HBsAg和HBcAg表达。结果免疫后1～2周,DC/Ad-S比DC/HBsAg和pcDNA3．1(+)-S诱导Tc分泌干扰索γ(IFN-γ)和特异性CTL均显著增强,而DC/ HBsAg组CTL较pcDNA3．1(+)-S组增强(P＜0．05)；DC/HBsAg免疫后1、2、4周CTL迅速减弱,DC/Ad-S在1、2周CTL差异不明显,但至4周时明显减弱。免疫后1～4周,对Tg鼠血清HBsAg、HBV DNA及肝组织HBcAg和HBsAg表达的抑制作用最强为DC/Ad-S免疫,其次为DC/HBsAg,显著强于pcDNA3．1(+)-s(P＜0．05或P＜0．01)。肝脏组织学、血清抗-HBs和ALT水平各组差异无统计学意义。结论Ad-S转染的DC比HBsAR冲击的DC和DNA疫苗诱导更强的Tcl和CTL应答,能较迅速抑制HBV转基因小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝脏HBcAg和HBsAg表达。

关键词：肝炎表面抗原乙型树突细胞腺病毒科 T淋巴细胞细胞毒性小鼠转基因

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我国4个钩端螺旋体血清群lipL21基因序列分析及其表达产物的鉴定

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中国人兽共患病杂志 2005年第9期21卷 744-747页

作者：刘云英罗冬娇严杰浙江大学医学院病原生物学教研室杭州310031 杭州师范学院基础医学部

目的本文采用高保真PCR从我国主要流行的问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株、流感伤寒群临型56609株及腐生性双曲钩体参考标准株三宝垄群patoc型PatocⅠ株基因组DNA中扩增了全长lipL21基因片段。序列分析结果表明... 详细信息

目的本文采用高保真PCR从我国主要流行的问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株、流感伤寒群临型56609株及腐生性双曲钩体参考标准株三宝垄群patoc型PatocⅠ株基因组DNA中扩增了全长lipL21基因片段。序列分析结果表明,所克隆的4株钩体lipL21基因与已报道的相应序列(GenBankNo.:AY187271)比较,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.64～99.82%和99.46～100%。所构建的问号钩体黄疸出血群赖型56601株lipL21基因原核表达系统在IPTG诱导下,能有效地表达目的重组蛋白rLipL21,其产量约为细菌总蛋白的10%。Westernblot结果证实,兔抗钩体TR/patocⅠ属特异性抗原血清能识别rLipL21并与之结合。上述实验结果提示,lipL21基因序列非常保守,其表达产物有良好免疫原性,可作为研制通用型钩体基因工程疫苗的候选抗原。

关键词：问号钩端螺旋体 LipL21基因克隆/表达免疫原性/鉴定

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感染细胞内问号钩端螺旋体吞噬泡形成及其与溶酶体的融合

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第9期27卷 792-796页

作者：刘云英罗冬娇郑伟李立伟严杰浙江大学医学院病原生物学系杭州310058 杭州师范学院基础医学部病原生物学教研室

目的了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染宿主细胞后吞噬泡形成、吞噬泡与溶酶体融合及感染细胞超微结构改变。方法用问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核巨噬样细胞J774A.1和猴肾成纤维细胞Cos-7。采用透射电镜观察J774A.1细胞和C... 详细信息

目的了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染宿主细胞后吞噬泡形成、吞噬泡与溶酶体融合及感染细胞超微结构改变。方法用问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核巨噬样细胞J774A.1和猴肾成纤维细胞Cos-7。采用透射电镜观察J774A.1细胞和Cos-7细胞胞内钩体吞噬泡的形成及感染细胞超微结构的改变。采用免疫双荧光染色法和激光共聚焦显微镜,观察含钩体吞噬泡与溶酶体融合情况。结果问号钩体56601株感染J774A.1细胞30 min、感染Cos-7细胞15 min即可在胞浆中发现膜包绕的含钩体吞噬泡,吞噬泡内钩体均保持原有生理弯曲。56601株问号钩体感染Cos-7细胞2h后,钩体吞噬泡膜开始消失,但未发现J774A.1细胞内钩体吞噬泡膜消失的现象。J774A.1细胞内钩体吞噬泡与溶酶体发生共区域化,表明吞噬泡与溶酶体发生融合。J774A.1细胞感染钩体后出现染色质浓缩形成的凋亡小体样结构、细胞空泡变性、线粒体肿胀等超微结构病变,但Cos-7细胞感染钩体后其超微结构基本正常。结论问号钩体感染J774A.1细胞和Cos-7细胞后可迅速形成吞噬泡并可能与钩体Ⅲ型分泌系统产物有关。J774A.1细胞内钩体吞噬泡可与溶酶体发生融合。不同细胞的钩体吞噬泡膜消失及超微结构改变有明显差异。

关键词：问号钩端螺旋体 J774A.1细胞/Cos-7细胞吞噬泡/溶酶体融合超微结构改变

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葡萄球菌肠毒素B基因原核表达系统的构建及其表达产物促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的研究

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浙江大学学报（理学版） 2006年第5期33卷 553-558页

作者：毛亚飞徐水凌罗冬娇严杰浙江大学医学院病原生物学教研室浙江杭州310031 杭州师范学院基础医学部浙江杭州310018

构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B，SEB）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段，T—A克隆后测序，构建SE... 详细信息

构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B，SEB）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段，T—A克隆后测序，构建SEB基因原核表达系统pET32α-SEB—***2IDE3．采用SDS-PAGE检测rSEB表达产量，Ni—NTA亲和层析法提纯rSEB．采用TCID50法测定rSEB对Vero细胞的细胞毒性作用并计算TCID50值．采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEB体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝腺癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用．与公布的相关序列比较，所克隆的SEB基因核苷酸序列相似性为100％．rSEB表达量约为细菌总蛋白的40％．rSEB对Vero细胞的TCIC50为3．02μg．5．0～20．0μg／ml的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P〈0．05）．5．0～20．0μg／ml rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P〈0．05）．本研究成功地构建了rSEB高效原核表达系统．rSEB仍然具有生物学活性．所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEB突变体的筛选奠定了基础．

关键词：葡萄球菌肠毒素B SEB基因/克隆原核表达系统/构建重组蛋白/表达细胞毒性淋巴细胞/增殖肿瘤细胞/抑制

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葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

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中国病理生理杂志 2007年第1期23卷 163-167页

作者：徐水凌毛亚飞张梅光罗冬娇严杰浙江大学医学院病原生物学教研室浙江杭州310031 嘉兴学院医学院微生物与免疫学教研室浙江嘉兴314001 杭州师范学院基础医学部浙江杭州310018

目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法:采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建SEA基因原核表达系统***21DE... 详细信息

目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法:采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建SEA基因原核表达系统***21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID50法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC50值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞(PBMC)的促增殖作用以及对HepG2细胞(人肝癌细胞)、HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)的生长抑制作用。结果:与公布的相关序列比较,所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC50为3.14μg。1.0-20.0mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0-20.0mg/LrSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。

关键词：葡萄球菌肠毒素A 基因表达原核表达 HepG2细胞 HeLa细胞 Veto细胞

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我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第11期26卷 979-984页

作者：罗冬娇胡野孙百莉田菊霞胡美多严杰杭州师范学院基础医学部 310018 浙江金华职业技术学院医学院浙江大学医学院病原生物学教研室

目的分析我国15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列,构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性,了解lipL21基因自然表达状况。方法高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Patoc型PatocⅠ株基因组... 详细信息

目的分析我国15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列,构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性,了解lipL21基因自然表达状况。方法高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Patoc型PatocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段,T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白,用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipl21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体,该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21,双曲钩体则否。结论我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜,双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性,有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。

关键词：钩端螺旋体 lipL21基因属特异性蛋白抗原重组表达外膜蛋白免疫原性

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蔷薇科植物果核油性提取物体外抗真菌细菌作用

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中国公共卫生 2005年第12期21卷 1462-1463页

作者：罗冬娇田菊霞周金成李立伟严杰杭州师范学院基础医学部杭州310018 浙江大学医学院病原生物学教研室

目的观察蔷薇科植物果核油性提取物初提液和提纯液体外抗病原真菌和细菌的作用.方法以二性霉素B、阿莫西林、庆大霉素为对照,分别采用二倍平皿稀释法和试管法测定油性提取物初提液和提纯液对假丝酵母菌、毛癣菌、金黄色葡萄球菌和大肠... 详细信息

目的观察蔷薇科植物果核油性提取物初提液和提纯液体外抗病原真菌和细菌的作用.方法以二性霉素B、阿莫西林、庆大霉素为对照,分别采用二倍平皿稀释法和试管法测定油性提取物初提液和提纯液对假丝酵母菌、毛癣菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌临床菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC).结果初提液和提纯液对79株假丝酵母菌菌株的MIC90分别为1.25%和2.5%(V/V)、对34株毛癣菌的MIC90分别为0.62%～1.25%和1.25%～2.5%(V/V).初提液和提纯液对38株金黄色葡萄球菌、20株大肠埃希菌的MIC90均分别为0.31%和0.62%(V/V).0.31%初提液作用15min、0.62%提纯液作用30min可杀灭白假丝酵母菌7374株和红色毛癣菌6180株.0.16%初提液作用5min、0.31%提纯液作用15min可杀灭金黄色葡萄球菌ATCC25923株和大肠埃希菌ATCC25922株.结论较低浓度的蔷薇科植物果核油性提取物初提液和提纯液即有体外抑制和杀灭常见皮肤和粘膜感染病原真菌和细菌的作用,具有成为高效外用消杀剂的前景.

关键词：蔷薇科植物果核油性提取物抑菌作用杀菌作用

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树突状细胞与乙型肝炎病毒慢性感染

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杭州师范学院学报（自然科学版） 2005年第3期4卷 234-237页

作者：黄茵杭州师范学院基础医学部微生物与免疫学教研室浙江杭州310018

乙型肝炎病毒感染后易慢性化或形成携带状态,宿主免疫应答缺陷或不足被认为是一个重要原因。树突状细胞是能力最强的抗原提呈细胞,是免疫应答的启动者和调节者。近年来已认识到,乙型肝炎病毒慢性携带者的树突状细胞的表型和功能均显示异... 详细信息

乙型肝炎病毒感染后易慢性化或形成携带状态,宿主免疫应答缺陷或不足被认为是一个重要原因。树突状细胞是能力最强的抗原提呈细胞,是免疫应答的启动者和调节者。近年来已认识到,乙型肝炎病毒慢性携带者的树突状细胞的表型和功能均显示异常,可能与病毒持续感染有关,恢复其树突状细胞抗原提呈功能的免疫治疗是有效应对慢性乙肝病毒感染的策略之一。本文对该领域研究进展作一综述。

关键词：乙型肝炎病毒慢性感染树突状细胞免疫治疗

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结核分枝杆菌特异性38kD多肽抗原提纯及其血清学诊断价值的研究

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中国人兽共患病学报 2007年第5期23卷 466-469页

作者：冯雪鸣张萍杭州师范学院基础医学部微生物学教研室杭州310036 浙江省望江山疗养院检验科

目的提纯结核分枝杆菌特异38kD多肽抗原,建立基于38kD多肽抗原(P38)的斑点金免疫渗滤法(DIGFA)检测结核病人血清标本,评价38kD多肽用于结核病血清学诊断抗原的实际价值。方法采用超声破碎、SDS-PAGE、切胶浸泡回收法提取结核分枝杆菌H3... 详细信息

目的提纯结核分枝杆菌特异38kD多肽抗原,建立基于38kD多肽抗原(P38)的斑点金免疫渗滤法(DIGFA)检测结核病人血清标本,评价38kD多肽用于结核病血清学诊断抗原的实际价值。方法采用超声破碎、SDS-PAGE、切胶浸泡回收法提取结核分枝杆菌H37Rv株的38kD多肽抗原。建立以38kD多肽为包被抗原的DIGFA(P38-DIGFA),并检测147例临床确诊的活动性肺结核病人血清标本。同时建立以结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)为包被抗原的DIGFA(LAM-DIGFA)作为对照。结果结核分枝杆菌H37Rv株38kD多肽抗原提取物经SDS-PAGE后仅显示为单一的条带,并可与临床确诊的肺结核病人阳性血清标本呈阳性免疫印迹反应。P38-DIGFA和LAM-DIGFA检测肺结核病人血清标本的总阳性率分别为84.4%(124/147)和76.2%(112/147),其中59份痰涂片及培养均阳性的肺结核病人血清标本P38-DIGFA和LAM-DIGFA阳性率分别为88.1%(52/59)和84.7%(50/59),88份痰涂片及培养均阴性的肺结核病人血清标本P38-DIGFA和LAM-DIGFA阳性率分别为81.8%(72/88)和70.5%(62/88),60例气管炎病人血清标本阳性率分别为13.3%(8/60)和6.7%(4/60),120例健康人血清标本阳性率分别为5.8%(7/120)和5.0%(6/120)。各P38-DIGFA和LAM-DIGFA检测阳性率之间均无显著性差异。结论结核分枝杆菌38kD多肽作为抗原用于结核病血清学检测时,其敏感性和特异性与LAM相似,可应用于研发结核病血清学诊断试剂盒。

关键词：结核分枝杆菌 38 kD多肽抗原斑点金免疫渗滤法血清学诊断

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