目的探讨高糖培养肾小管上皮细胞中miR-27 a调控分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)对细胞向间质细胞转分化(EMT)的影响。方法将NRK-52E细胞分为正常糖(NG组)和高糖(HG组)两组,利用RT-qPCR检测NRK-52E细胞中miR-27 a、Sfrp 1的表达情况,Western blot检测NRK-52E细胞中Sfrp1、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原(col-Ⅳ)的蛋白表达;将NRK-52E细胞分为野生型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics阴性对照组(wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mnc组)、野生型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics组(wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m组)、突变型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics阴性对照组(mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mnc组)以及突变型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics组(mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m),通过双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光值与海肾荧光值的比值,验证miR-27 a对Sfrp1表达的影响;在高糖诱导下,利用细胞转染实验将NRK-52E细胞设miR-27 a mimics阴性对照组(miR-27 a mnc组)、miR-27 a mimics组(miR-27 a m组)、miR-27 a inhibitor阴性对照组(miR-27 a inc组)以及miR-27 a inhibitor组(miR-27 a i组),通过RT-qPCR检测各组细胞中miR-27 a、Sfrp 1 mRNA的表达,Western blot检测各组细胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白的表达水平。结果RT-qPCR结果显示,与NG组比较,HG组miR-27 a表达水平增高(P<0.05),Sfrp 1 mRNA表达水平降低(P<0.05);Western blot结果显示,与NG组比较,HG组α-SMA、col-Ⅳ蛋白水平增高(P<0.05),Sfrp1、E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05);荧光素酶报告基因显示,wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m组荧光素酶活性明显低于wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mnc组(P<0.05),而mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27a mnc组与mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m组荧光素酶活性未见明显变化(P>0.05);细胞转染RT-qPCR结果显示,与miR-27 a mnc组比较,miR-27 a m组miR-27 a表达增加(P<0.05),而Sfrp 1 mRNA表达降低(P<0.05);与miR-27 a inc组比较,miR-27 a i组miR-27 a表达降低(P<0.05),而Sfrp 1 mRNA表达增加(P<0.05);Western blot结果显示,与miR-27 a mnc组比较,miR-27 a m组α-SMA、col-Ⅳ蛋白表达增加(P<0.05),Sfrp1、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05);与miR-27a inc组比较,miR-27 a i组α-SMA、col-Ⅳ蛋白表达降低(P<0.05),Sfrp1、E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05)。结论miR-27 a可以通过抑制Sfrp1的表达促进肾小管EMT,参与糖尿病肾病肾纤维化的发生。
暂无评论