检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：黄萍胡波宋艳华范志宇魏后军仇汝龙薛家宾王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培... 详细信息

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培养,极大阻碍了对该病毒致病机制的深入研究。病毒受体是病毒侵入宿主细胞的主要门户,病毒与宿主细胞上的受体特异性结合后侵入细胞,进而组装释放新的病毒颗粒感染其他细胞得以增殖。受体研究可揭示病毒与宿主之间的作用机制,因此成为研究者关注的焦点。本实验室前期研究结果显示RHDV农壳蛋白VP60 P2亚区的高变区与层黏连蛋白受体(LamR)蛋白存在直接的相互作用,提示LamR蛋白在病毒吸附入侵宿主细胞过程中可能发挥着重要作用。本研究目的为了探究LamR对RHDV吸附与入侵等的影响,本实验首先将完整的LamR序列通过同源重组法克隆入慢病毒表达质粒pLVX-mCherry-N1。将该质粒与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLp-VSV/G共转染到293T细胞,包装成含LamR基因的重组慢病毒。将收获的慢病毒在Polybrene的介导下感染RKl3细胞,采用嘌呤霉素筛选筛选出l株能稳定表达的细胞系,命名为RKl3-LamR。经免疫荧光和Western blotting检测,结果显示该细胞株能够稳定表达LamR蛋白,成功构建了稳定表达LamR蛋白的RK13细胞系。另外,为研究RHDV对RK13-LamR的感染性,本实验用RHDV接种正常RKl3细胞与RKl3-LamR细胞系,采用间接免疫荧光法检测RHDV对细胞的吸附作用;通过对RHDV接种量的优化,选择合适的病毒量接种RKl3细胞和RKl3-LamR细胞,并收集接种RHDV后不同时间点的细胞样品,采用血凝试验(HA)测定病毒的HA效价;通过qRT-PCR反应,进一步检测RHDV在RKl3-LamR细胞中的复制情况。结果表明,LamR蛋白可以促进RHDV对RK13细胞的吸附,但并未检测到病毒在细胞内的复制和增殖,说明层粘连蛋白可能是RHDV感染肝细胞过程中的一个受体,这为进一步研究RHDV对肝细胞的入侵及RHDV的致病机理提供了重要的线索。

关键词： RHDV 慢病毒载体 LamR RK13细胞吸附

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猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2017年第8期48卷 1491-1498页

作者：武昱孜熊祺琰刘蓓蓓张珍珍王佳华利忠韦艳娜邵国青江苏省农业科学院兽医研究所、农业部兽用生物制品工程技术重点实验室、国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室南京210014

建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测... 详细信息

建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。

关键词：猪肺炎支原体猪鼻支原体双重荧光定量PCR

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不同养殖模式下小反刍兽疫母源抗体消长规律

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江苏农业科学 2018年第3期46卷 160-162页

作者：郝飞李文良毛立许宝军唐朝忠张纹纹李基棕杨蕾蕾侯福银时凯王建辉魏勇陈应江江杰元江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省盱眙县动物疫病预防控制中心江苏盱眙211700 江苏沿海地区农业科学研究所江苏盐城224002 江苏省睢宁县畜牧兽医技术指导站江苏睢宁221200

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病,是世界动物卫生组织法定须报告的具有重要经济影响的跨境传染病,山羊和绵羊易感,具有较高的感染率和死亡率。疫苗接种是预防控制小反刍兽疫的重要手段。当前,规模化羊场... 详细信息

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病,是世界动物卫生组织法定须报告的具有重要经济影响的跨境传染病,山羊和绵羊易感,具有较高的感染率和死亡率。疫苗接种是预防控制小反刍兽疫的重要手段。当前,规模化羊场对小反刍兽疫的防控均实施了以疫苗接种为主的综合防制措施,但抗体检测发现时常存在羔羊免疫失败现象,这可能是羔羊首免日龄不当受到母源抗体干扰而导致的。为了解不同养殖模式与养殖条件下羔羊母源抗体的消长规律,为制定科学合理的小反刍兽疫免疫程序提供依据,在江苏省选择8个不同的山羊和湖羊养殖场,分别选取1月龄羔羊6只,定期采血,采用商品化竞争ELISA试剂盒检测羔羊母源抗体变化情况。结果表明,不同养殖场PPRV母源抗体的变化规律不一致,存在较大差异,大部分持续时间为1~3个月,个别湖羊场羔羊4月龄时母源抗体仍呈现极高水平。生产实际中须要做好母羊和羔羊小反刍兽疫抗体水平的监测,根据监测结果制定科学的免疫程序。

关键词：养殖模式羔羊小反刍兽疫母源抗体消长规律感染率死亡率疫苗接种

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犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达

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中国兽医科学 2017年第4期47卷 448-454页

作者：王晶宇欧阳伟王永山夏兴霞诸玉梅王晓丽潘群兴孟凯毕振威安欣楼晶瑶姚火春南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其... 详细信息

为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。

关键词：犬干扰素α4(CaIFN-α4) CHO细胞真核表达慢病毒绿色荧光蛋白

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兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗临床免疫效力试验

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗临床免疫效力试验

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中国畜牧兽医学会养兔学分会第二届学术交流大会

作者：范志宇胡波魏后军宋艳华薛家宾姜平王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学

本研究依据农业部兽用生物制品临床试验批件对南京某公司中试生产的3批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）在六家养殖场对不同品种、不同日龄家兔进行免疫,通过疫苗注射后的临床观察、攻毒保护试验等开展该疫苗免疫期内... 详细信息

本研究依据农业部兽用生物制品临床试验批件对南京某公司中试生产的3批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）在六家养殖场对不同品种、不同日龄家兔进行免疫,通过疫苗注射后的临床观察、攻毒保护试验等开展该疫苗免疫期内免疫效力等相关研究工作。选择35～42日龄幼兔、2月龄健康家兔,使用批号2013002中试产品分别在江苏A兔场、浙江A兔场、江苏C兔场和浙江B兔场进行免疫,使用批号2013003中试产品在山东A兔场进行免疫,使用批号2013004中试产品在江苏B兔场进行免疫;使用批号129083同类疫苗分别在六家兔场进行免疫;同时有一定数量的不同日龄家兔留作对照兔,皮下注射灭菌生理盐水。在注射后第150、210日分别在六家试验兔场随机选择中试产品和同类疫苗免疫家兔及对照兔,5只/组/批/次,采用攻毒法进行效力检验。对六家临床试验兔场家兔,免疫后每隔1个月进行一次血液采集,分离血清,使用血凝抑制（HI）方法和ELISA方法进行抗体检测。结果显示,使用中试产品相继在六家养殖场共免疫家兔26133只,其中幼兔24313只、2月龄兔1820只,家兔在试验期间均未发生兔出血症。攻毒结果显示,中试产品疫苗对不同品种家兔可产生7个月的保护。同类疫苗对不同品种的家兔可产生6个月的保护。抗体检测结果显示,7个月内家兔血清抗体HI效价和OD值均维持在较高水平,不同批次疫苗免疫兔血清抗体水平没有显著差异。结论:兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）中试产品可以保护免疫兔场不发生兔出血症,免疫期为7个月,临床效力检验合格。该疫苗于2017年2月获得国家一类新兽药注册证书（[2017]新兽药证字06号）,该疫苗也必将替代兔病毒性出血症组织灭活疫苗,在兔出血症的免疫防控中起到重要作用。

关键词：兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗效力免疫期

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犬流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2017年第6期47卷 680-686页

作者：楼晶瑶王晓丽欧阳伟夏兴霞诸玉梅潘群兴王晶宇安欣姚凌云王永山刘永杰南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心.江苏南京210014

旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH... 详细信息

旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH10,穿梭质粒转染sf-9昆虫细胞,获得重组病毒P1-NP。病毒传至第3代后,用Western-blot及IFA鉴定昆虫细胞表达的蛋白与兔抗犬流感病毒NP蛋白多克隆抗体及鼠抗CIV血清发生特异性反应。NP蛋白纯化后作为抗原,建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。优化后确定蛋白最佳包被浓度为2 g/mL,血清最佳稀释度为1∶100。用建立的间接ELISA方法和血凝抑制(HI)同时检测136份血清样品,ELISA法检出129份阳性,检出率为94.85%;HI检出120份阳性,检出率为88.23%,二者符合率为93.38%,ELISA检测方法的阳性率高于血凝抑制。结果表明,利用昆虫细胞表达的NP蛋白做为抗原,建立的检测CIV抗体的间接ELISA方法特异性好,重复性高,可用于犬流感的诊断和流行病学调查。

关键词：犬流感病毒 NP蛋白杆状病毒表达系统间接ELISA

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不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析

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畜牧兽医学报 2017年第12期48卷 2365-2373页

作者：武昱孜邢宪平韦艳娜熊祺琰冯志新邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京农业大学南京210095 肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心南京210095

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析... 详细信息

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对,分析3种疫苗菌株和4个标准株之间核苷酸及氨基酸差异。结果发现,疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%,与J株、232株相似性为99.1%,与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%;而与疫苗株168株相似性为97.5%;三个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%,差异主要发生在R1区重复序列的次数上。本研究为临床猪支原体肺炎活疫苗菌株的检测及不同菌株之间的差异鉴定研究奠定了基础。

关键词：猪支原体肺炎猪肺炎支原体疫苗株 P46基因 P97基因

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1株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定

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中国人兽共患病学报 2017年第11期33卷 962-966页

作者：田瑞雨熊祺琰倪博王佳韦艳娜冯志新邵国青江苏省农业科学院兽医研究所.农业部兽用生物制品工程技术重点实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095 省部共建国家重点实验室培育基地 -江苏省食品质量安全重点实验室南京210014 江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心南京210095

目的制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体,用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究。方法将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价、特异性进行鉴定。将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间... 详细信息

目的制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体,用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究。方法将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价、特异性进行鉴定。将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间接免疫荧光试验。结果获得了1株猪鼻支原体单抗,命名为Mhr-08。该单抗的亚型属于IgG1,轻链为κ型。ELISA测定该纯化单抗效价为1∶102 400,Western-blot检测结果表明,该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在43kDa处出现特异性反应条带,与猪其他支原体、大肠杆菌及KM2培养基无交叉反应;该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体,可成功应用于菌落免疫杂交试验;将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体。结论成功制备和鉴定出1株猪鼻支原体单克隆抗体,该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断及致病机理的研究提供了工具。

关键词：猪鼻支原体单克隆抗体特异性

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EHEC O157:H7 z3276基因缺失株构建及其生物学特性

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微生物学通报 2017年第12期44卷 2958-2966页

作者：张碧成张雪寒孙小涵范红结何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室江苏南京210014 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

【目的】肠出血性大肠杆菌O157:H7是世界范围内重要的动物源性致病菌之一,可感染人。I型菌毛是多种致病性大肠杆菌(如肾盂肾炎型大肠杆菌等)可表达的一种黏附结构,与细菌吸附黏膜表面密切相关。然而,O157:H7 fim操纵子上几个核苷酸的缺... 详细信息

【目的】肠出血性大肠杆菌O157:H7是世界范围内重要的动物源性致病菌之一,可感染人。I型菌毛是多种致病性大肠杆菌(如肾盂肾炎型大肠杆菌等)可表达的一种黏附结构,与细菌吸附黏膜表面密切相关。然而,O157:H7 fim操纵子上几个核苷酸的缺失却导致其不能表达I型菌毛。BLAST比对结果表明O157:H7独有的开放阅读框z3276编码的氨基酸序列与其他大肠杆菌I型菌毛高度同源,这可能是对O157:H7不能表达I型菌毛的补偿机制,但确切功能尚不清楚。本文探究z3276基因的生物学功能。【方法】利用O157:H7 86-24参考菌株构建z3276基因缺失株(?z3276),并构建其互补株(C?z3276),进而比较亲本株、?z3276与C?z3276的生物学特性及对小鼠致病性差异。【结果】与亲本株相比,?z3276进入对数生长期的时间延后,在半固体琼脂平板上的迁移直径明显缩小,生物被膜形成能力显著减弱。?z3276对HEp-2细胞的黏附和侵袭能力并无明显变化,但对IPEC-J2细胞的侵袭能力明显减弱。在小鼠攻毒试验中,?z3276组排菌数量减少、排菌持续时间缩短。C?z3276各项特性均能回复到与亲本株一致的水平。【结论】z3276基因可能是O157:H7重要的毒力相关因子。

关键词： O157:H7 z3276基因缺失株致病性

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H9N2亚型禽流感病毒感染树突状细胞的转录组分析

H9N2亚型禽流感病毒感染树突状细胞的转录组分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会

作者：刘青涛李银杨婧赵冬敏刘宇卓韩凯凯黄欣梅毕可然刘娜田宇杰江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言H9N2亚型禽流感病毒（AIVs）属于低致病性禽流感病毒,在临床上并不能像H5和H7高致病性禽流感病毒那样导致鸡的大批死亡。但是,H9N2 AIVs感染却可以引起鸡的免疫抑制,进而导致疫苗的免疫失败或者其它病原的继发感染,是目前危害我国... 详细信息

引言H9N2亚型禽流感病毒（AIVs）属于低致病性禽流感病毒,在临床上并不能像H5和H7高致病性禽流感病毒那样导致鸡的大批死亡。但是,H9N2 AIVs感染却可以引起鸡的免疫抑制,进而导致疫苗的免疫失败或者其它病原的继发感染,是目前危害我国家禽养殖业的主要病原之一。然而,

关键词：禽流感病毒树突状细胞

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