检索结果-内蒙古大学图书馆

中国人兽共患病学报 2013年第9期29卷 877-882页

作者：熊祺琰纪燕刘占军马庆红冯志新刘茂军白方方邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

目的猪鼻支原体(Mhr)是临床猪场常见病原菌之一,同时研究证实其与多种人类肿瘤有关。目前对Mhr的血清学检测尚无有效的方法。本研究以Mhr可变脂蛋白(vlp)家族为对象,设计vlp家族蛋白重复区片段融合蛋白,以作为检测用包被抗原使用。方法... 详细信息

目的猪鼻支原体(Mhr)是临床猪场常见病原菌之一,同时研究证实其与多种人类肿瘤有关。目前对Mhr的血清学检测尚无有效的方法。本研究以Mhr可变脂蛋白(vlp)家族为对象,设计vlp家族蛋白重复区片段融合蛋白,以作为检测用包被抗原使用。方法根据大肠杆菌的密码子偏嗜性,设计并构建串联表达7种Mhr可变脂蛋白vlpA、B、C、D、E、F、G重复区片段的重组蛋白vlpA-G基因。将该基因片段装入pET-32a(+)载体中转化大肠杆菌,筛选鉴定获得阳性工程菌。IPTG诱导表达,镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白vlpA-G。Western Blot鉴定该重组蛋白与Mhr阳性血清的反应能力,并利用该重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA方法用于检测猪血清中的Mhr抗体。结果构建表达vlpA-G重组蛋白的基因工程菌,经PCR及DNA测序正确。IPTG诱导后出现明显蛋白条带,经镍柱亲和层析纯化获得vlpA-G重组蛋白。Western Blot试验证明重组蛋白vlpA-G能够和Mhr阳性兔血清产生明显的阳性杂交带;利用重组vlpA-G为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法可成功检测Mhr阳性猪血清,证明该重组vlpA-G蛋白具有良好的反应原性。结论本研究构建了重组蛋白vlpA-G并证实该蛋白具有良好的反应原性,可作为Mhr血清学诊断方法研究的候选抗原,同时也为Mhr重组蛋白疫苗提供可选抗原。

关键词：猪鼻支原体可变脂蛋白原核表达反应原性

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猪肺炎支原体黏附猪肾细胞模型建立及体外黏附特性研究

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畜牧兽医学报 2013年第5期44卷 772-777页

作者：张旭冯志新武昱孜车巧林刘茂军熊祺琰华利忠李彬邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

为了建立猪肺炎支原体全菌体外黏附细胞模型及初步探讨其对不同细胞系的黏附特性,选取实验室保存的Mhp野毒分离株(XLW-1、XLW-2、XLW-3、WX株)、国际标准株232、弱毒疫苗168株感染猪肾传代细胞系(PK15),同时利用本实验室已建立的Mhp间... 详细信息

为了建立猪肺炎支原体全菌体外黏附细胞模型及初步探讨其对不同细胞系的黏附特性,选取实验室保存的Mhp野毒分离株(XLW-1、XLW-2、XLW-3、WX株)、国际标准株232、弱毒疫苗168株感染猪肾传代细胞系(PK15),同时利用本实验室已建立的Mhp间接免疫荧光检测方法检测各菌株对PK15的黏附特性。结果发现,不同Mhp株全菌均可黏附PK15细胞,但不同菌株黏附能力存在差异。其黏附能力强弱依次为野毒株XLW-1株、WX株、疫苗168株、国际标准株232、野毒株XLW-2、XLW-3株。选取黏附能力较强的XLW-1株,继续探讨其对猪原代气管上皮细胞、猪肺泡上皮细胞(SJPL)、猪肺泡巨噬细胞(3D4/31)、恒河猴肾细胞(Marc145)的黏附性。XLW-1株能在体外黏附不同的细胞系,但对不同细胞的黏附能力存在差异,其中对猪源的原代分离的猪气管上皮细胞、SJPL细胞系、3D4/31细胞系黏附性均较强,而对非猪源的Marc145细胞系的黏附性较弱。本研究结果表明,Mhp全菌体可在多种细胞系上建立黏附感染模型,不同Mhp菌株的黏附能力存在着差异,且同一菌株对不同细胞系的黏附特性也存在差异。

关键词：猪肺炎支原体体外感染模型黏附特性

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兔补体C3d基因cDNA的克隆、鉴定及原核表达

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中国兽医学报 2013年第2期33卷 201-205页

作者：魏后军王芳胡波范志宇薛家宾徐为中江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

以兔肝脏组织中提取的总RNA为模板,通过巢式RT-PCR扩增出C3dcDNA,克隆测序后将其连接至表达载体pET-32a,转化入*** BL21,用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以包涵体形式存在并得... 详细信息

以兔肝脏组织中提取的总RNA为模板,通过巢式RT-PCR扩增出C3dcDNA,克隆测序后将其连接至表达载体pET-32a,转化入*** BL21,用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以包涵体形式存在并得到高效表达;Western blot进一步证实,表达的蛋白为C3d。本研究为开发利用兔C3d奠定了基础。

关键词：兔C3d 巢式RTPCR 原核表达

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快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价

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中国兽医学报 2013年第7期33卷 1027-1031页

作者：张雪寒何孔旺叶青倪艳秀温立斌李彬王小敏周俊明郭容利江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验。结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果。在灵敏度... 详细信息

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验。结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果。在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1CFU/g。在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应。试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求。

关键词：环介导恒温扩增技术 rfbE基因快速检测

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重组猪鼻支原体P37蛋白的原核表达及免疫原性分析

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 840-844页

作者：熊祺琰刘占军马庆红冯志新刘茂军白方方邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

P37是猪鼻支原体(Mhr)的主要免疫原之一,也是Mhr中目前唯一已知的与肿瘤直接相关的抗原。为原核表达Mhr P37蛋白并分析其免疫原性,本研究通过人工合成能够在***中优势表达P37蛋白的编码序列,以pET-28a(+)为载体对P37重组蛋白进行原核表... 详细信息

P37是猪鼻支原体(Mhr)的主要免疫原之一,也是Mhr中目前唯一已知的与肿瘤直接相关的抗原。为原核表达Mhr P37蛋白并分析其免疫原性,本研究通过人工合成能够在***中优势表达P37蛋白的编码序列,以pET-28a(+)为载体对P37重组蛋白进行原核表达。SDS-PAGE及western blot鉴定结果表明,表达的P37重组蛋白约为45.97 ku并能够被Mhr高免血清识别。利用纯化的重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法,检测结果显示与Mhr高免血清呈强阳性反应。此外,将P37重组蛋白免疫小鼠,能够诱导高滴度特异性抗体,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究结果为Mhr检测方法的建立、P37蛋白功能研究以及P37相关重组肿瘤疫苗和Mhr疫苗的研制奠定基础。

关键词：猪鼻支原体 P37蛋白原核表达免疫

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猪圆环病毒2型Rep蛋白基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国兽医学报 2013年第8期33卷 1154-1158页

作者：李文良毛立张纹纹王小敏茅爱华甘源江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的... 详细信息

采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的抗原性。利用纯化的重组蛋白rRep作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。抗原最适包被质量浓度为1mg/L(0.1μg/孔),待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000。用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清,结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为<5%和<10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用rRep-ELISA对113份血清样品进行检测,与rCap-ELISA结果比较,rRep-ELISA检测阳性率为50.44%(57/113),略低于后者的54.87%(62/113),2种方法检测符合率为88.5%(100/113),具有较好的一致性。这为PCV-2感染的流行病学调查和新型ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。

关键词： PCV-2 Rep蛋白原核表达 ELISA

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猪鼻支原体TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 833-836页

作者：白方方武昱孜刘茂军冯志新熊祺琰韦艳娜马庆红邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为建立快速检测猪鼻支原体(***)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良... 详细信息

为建立快速检测猪鼻支原体(***)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对***的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3%(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于***临床样品的检测,对***的快速和定量检测具有重要意义。

关键词：猪鼻支原体 p37基因荧光定量PCR

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gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒复制的影响

gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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中国畜牧兽医学会2014年学术年会

作者：欧阳伟王永山杜希宁刘华洁张海彬江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心南京师范大学生命科学学院

引言IBD仍是危害养鸡业的主要疫病之一,并呈现出新的流行特点:鸡群早期感染致多种疫苗免疫失败、不同发病鸡的日龄与病情差异很大,直接及间接造成的经济损失巨大,防治面临新的困难。现今使用的常规弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗等... 详细信息

引言IBD仍是危害养鸡业的主要疫病之一,并呈现出新的流行特点:鸡群早期感染致多种疫苗免疫失败、不同发病鸡的日龄与病情差异很大,直接及间接造成的经济损失巨大,防治面临新的困难。现今使用的常规弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗等存在着安全性、免疫保护效果差和生物安全等这样或那样的问题。这些问题的存在表明,当前亟需采用新的研究策略和技术方法进一步揭示IBDV感染的分子病

关键词：传染性法氏囊病病毒 gga-miR-9 miR

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巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用

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中国兽医学报 2013年第7期33卷 1007-1010页

作者：白方方武昱孜靳蒙蒙刘茂军冯志新熊祺琰邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。在特异性检测试验中,设计的引物不能... 详细信息

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01mg/L和3.01×10-4 mg/L。对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3%(12/41)和82.9%(34/41)。结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。

关键词：猪鼻支原体巢式PCR 检测

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不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附

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中国预防兽医学报 2013年第9期35卷 725-728页

作者：车巧林冯志新白方方刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为研究不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用,本研究采用体外培养的猪气管环检测不同毒力的猪肺炎支原体代表菌株对猪气管上皮细胞及纤毛的损伤情况,初步验证不同猪肺炎支原体代表菌株的毒力。应用间接免疫荧光技术研究不同猪肺... 详细信息

为研究不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用,本研究采用体外培养的猪气管环检测不同毒力的猪肺炎支原体代表菌株对猪气管上皮细胞及纤毛的损伤情况,初步验证不同猪肺炎支原体代表菌株的毒力。应用间接免疫荧光技术研究不同猪肺炎支原体分离株、标准株、168致弱株及疫苗株对猪肾细胞PK15、肺泡上皮细胞SJPL和猪肺泡巨嗜细胞3D4/31的黏附情况。结果表明猪肺炎支原体野毒株XLW-1能引起猪气管上皮细胞严重病变及纤毛损伤、脱落;国际标准弱毒株J株仅能引起猪气管上皮细胞轻微病变;168疫苗株既不能引起猪气管上皮细胞病变,也不能引起纤毛损伤。野毒株XLW-1、国际标准强毒株232株、弱毒株J株及168疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31,168致弱株可以黏附PK15和SJPL。野毒株、标准强毒株、标准弱毒株、168致弱株及疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31。

关键词：猪肺炎支原体不同毒力宿主细胞黏附间接免疫荧光

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