检索结果-内蒙古大学图书馆

中国畜牧兽医 2025年第1期52卷 1-12页

作者：谢蓓伊庭王悦孟春花钱勇张俊张建丽王慧利曹少先李隐侠江苏省农业科学院畜牧研究所江苏省畜禽精准育种工程研究中心农业农村部种养结合重点实验室南京210014

[目的]探讨湖羊蛋白酶体亚基β9(proteasome 20S subunit beta 9,PSMB9)基因编码区、启动子区序列特征、转录调控机制及其对成肌细胞增殖的影响。[方法]采用克隆测序法获得湖羊PSMB9基因编码区序列,根据绵羊PSMB9基因组的定位确定其启... 详细信息

[目的]探讨湖羊蛋白酶体亚基β9(proteasome 20S subunit beta 9,PSMB9)基因编码区、启动子区序列特征、转录调控机制及其对成肌细胞增殖的影响。[方法]采用克隆测序法获得湖羊PSMB9基因编码区序列,根据绵羊PSMB9基因组的定位确定其启动子区大小,并通过生物学软件分析PSMB9基因编码区和启动子区序列特性,采用Mega 5.0中的邻接法(Neighbor-Joining)构建基于PSMB9氨基酸序列的系统进化树;采用实时荧光定量PCR鉴定PSMB9基因在湖羊不同组织中的表达谱;利用双酶切法构建湖羊PSMB9基因过表达载体,采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力,通过实时荧光定量PCR检测PSMB9基因在C2C12细胞系中的过表达效果和增殖基因PCNA的表达水平。[结果]湖羊PSMB9基因编码区长660 bp,编码219个氨基酸残基,其核苷酸序列和氨基酸序列与哺乳动物(如人、牛、猪和小鼠)的相似性较高,PSMB9氨基酸中活性位点和β亚基相互作用位点均高度保守;系统进化树显示,湖羊与牛先聚在一起,再与猪、人和小鼠聚在一起,说明PSMB9在哺乳动物中相对保守。PSMB9基因启动子区含有1个CpG岛、2个GC-box(CCGCCC)和2个E-box(CANNTG),且存在SP1、KLF4、STAT3、YY1、CREB1等多种转录因子潜在结合位点。组织表达谱显示,PSMB9基因在湖羊各组织中广泛表达,其中在脾脏中表达量最高,肌肉次之。与对照组相比,在C2C12细胞系中过表达PSMB9基因后极显著提升了细胞的增殖能力(P<0.01),增殖标志基因PCNA表达水平极显著上调(P<0.01)。[结论]本研究成功克隆获得了湖羊PSMB9基因序列,该基因在哺乳动物中高度保守,启动子区含有重要调控元件、CpG岛和转录因子潜在结合位点。PSMB9基因在湖羊脾脏和肌肉组织中高表达,PSMB9基因过表达可促进成肌细胞的增殖。研究结果为进一步阐明PSMB9基因调控湖羊肌肉发育的分子机制提供依据。

关键词：湖羊 PSMB9基因克隆组织表达谱 C2C12细胞系细胞增殖

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不同胎次、泌乳阶段及体细胞水平的蒙荷杂交牛泌乳性能变化规律研究

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南京农业大学学报 2025年第1期48卷 197-205页

作者：陈坤琳夏淑雯沈阳阳丁强徐亮亮仲跻峰田雨王慧利江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014 江苏优源奶业产业研究院有限公司江苏南京211100

[目的]本文旨在通过比较不同胎次、泌乳阶段和体细胞水平的蒙荷杂交牛泌乳性能差异,分析其相关性和变化规律,为蒙荷杂交牛的精细化管理和乳品质提升提供理论依据。[方法]以蒙贝利亚为父本、自繁荷斯坦牛为母本的杂交一代泌乳牛为研究对... 详细信息

[目的]本文旨在通过比较不同胎次、泌乳阶段和体细胞水平的蒙荷杂交牛泌乳性能差异,分析其相关性和变化规律,为蒙荷杂交牛的精细化管理和乳品质提升提供理论依据。[方法]以蒙贝利亚为父本、自繁荷斯坦牛为母本的杂交一代泌乳牛为研究对象,提取其生产性能测定(dairy herd improvement,DHI)数据,分别按胎次(1 胎次、2 胎次)、泌乳阶段(0~99 d、100~199 d、200~299 d和≥300 d)、体细胞数(somatic cell count,SCC)(低SCC,0~1×10^(5) mL^(-1);中SCC,>1×10^(5)~2×10^(5) mL^(-1);高SCC,>2×10^(5) mL^(-1))进行分类和分组,采用Duncan's多重比较和Pearson相关性分析等方法进行比较研究。[结果]不同胎次蒙荷杂交牛产奶量存在极显著差异(P<0.01),第1胎次的产奶量显著低于第2胎次;产奶量与乳脂率呈显著负相关(P<0.05),脂蛋比与乳脂率呈极显著正相关(P<0.01)。不同泌乳阶段蒙荷杂交牛产奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比、尿素氮、体细胞数和体细胞评分均存在显著差异(P<0.05),泌乳阶段在0~99 d时产奶量最高、体细胞数最低。不同SCC水平蒙荷杂交牛泌乳天数、产奶量、乳脂率和脂蛋比存在显著差异(P<0.05),产奶量在低SCC时最高。在不同的SCC水平,总乳脂量和总乳蛋白量呈极显著正相关(P<0.01),在低、中SCC水平,乳脂率与脂蛋比呈显著正相关(P<0.05);在高SCC水平,乳脂率与乳蛋白率、脂蛋比呈显著正相关(P<0.05)。[结论]不同胎次、泌乳阶段和SCC水平的蒙荷杂交牛产奶量和乳成分存在显著差异,随着泌乳天数的增加,产奶量呈现先上升后下降的变化规律,第2胎次、泌乳早期和低SCC水平时的产奶量最高,并随着泌乳天数的增加产奶量呈现先上升后下降的变化规律,乳脂率、乳蛋白率和脂蛋比呈现先下降后上升的变化趋势。因此,针对不同胎次、泌乳阶段和体细胞水平制定相应的饲养管理方案,以充分发挥蒙荷杂交牛的生产潜力及杂种优势,提高经济效益。

关键词：蒙荷杂交牛胎次泌乳阶段体细胞水平泌乳性能变化规律

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海门山羊MSTN基因克隆、生物信息学分析及单碱基编辑的研究

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畜牧与兽医 2025年第5期57卷 24-30页

作者：夏潇潇王佳琳李玲佰伍加宋志贤岳恒曹少先袁玉国扬州大学兽医学院/扬州大学动物基因工程重点实验室江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学医学院江苏扬州225009 江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014

为探明海门山羊不同组织中肌肉生长抑制素(MSTN)基因表达规律及其编码蛋白结构特点,通过克隆海门山羊MSTN基因CDS序列并分析其生物特点,运用实时荧光定量PCR技术分析MSTN基因在不同组织中的表达水平,在MSTN基因第2、3外显子上设计3个单... 详细信息

为探明海门山羊不同组织中肌肉生长抑制素(MSTN)基因表达规律及其编码蛋白结构特点,通过克隆海门山羊MSTN基因CDS序列并分析其生物特点,运用实时荧光定量PCR技术分析MSTN基因在不同组织中的表达水平,在MSTN基因第2、3外显子上设计3个单碱基编辑靶位点,将构建的sgRNA质粒分别与胞嘧啶碱基编辑器YE1-BE3-FNLS电转入培养的海门山羊胎儿成纤维细胞中,筛选48 h后提取细胞基因组DNA,对PCR扩增靶位点序列进行Sanger测序和TA克隆分析。结果:海门山羊MSTN基因的CDS序列编码375个氨基酸,具有高度保守性。海门山羊不同组织中MSTN基因表达水平存在差异,其中骨骼肌的表达量最高;3条sgRNA均可在MSTN基因外显子上进行单碱基编辑,编辑效率分别为25%、37%和29%。结论:研究结果为进一步利用单碱基基因编辑技术培育MSTN基因突变海门山羊新品系提供了新的依据。

关键词：海门山羊肌肉生长抑制素单碱基编辑

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不同嫩度徐州牛肌肉转录组比较分析

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中国畜牧兽医 2025年第2期52卷 522-533页

作者：沈阳阳安振江高林娜夏淑雯陈坤琳丁强高运东薛金果仲跻峰王慧利江苏省农业科学院畜牧研究所江苏省畜禽精准育种工程研究中心农业农村部种养结合重点实验室南京210014 南京农业大学动物科技学院南京210095 河北工程大学生命科学与食品工程学院邯郸056038 山东奥克斯畜牧种业有限公司济南276399 徐州市动物疫病预防控制中心徐州221151

[目的]探究徐州牛不同嫩度背最长肌间的基因表达差异,挖掘相关调控基因和信号通路,为进一步研究徐州牛肌肉生长调控的作用机制提供理论依据。[方法]本研究以江苏地方特色牛种——徐州牛为研究对象,屠宰后对背最长肌进行剪切力测定,依据... 详细信息

[目的]探究徐州牛不同嫩度背最长肌间的基因表达差异,挖掘相关调控基因和信号通路,为进一步研究徐州牛肌肉生长调控的作用机制提供理论依据。[方法]本研究以江苏地方特色牛种——徐州牛为研究对象,屠宰后对背最长肌进行剪切力测定,依据剪切力值大小分为高嫩度组6头(剪切力<5.5 kg)和低嫩度组4头(剪切力>7 kg),并对两组肌肉组织进行转录组测序,对数据进行过滤、质控、比对、定量后使用R语言DEseq2包筛选差异表达基因并进行功能富集分析。对差异极显著基因胱抑素B(cystatin B,CSTB)进行物种相似性比对及蛋白理化性质等分析。[结果](1)转录组结果显示,相对于低嫩度组,高嫩度组中有94个基因上调、37个基因下调,位于前二十的差异表达基因包括CSTB、VWF、DIRAS3、CDKN1A、CFB等。(2)GO和KEGG富集分析发现,差异表达基因主要涉及凝血、免疫效应、伤口愈合等生物学过程,以及参与脂质代谢的Wnt信号通路等。基因通路网络分析发现,生物过程和分子功能中共同存在CSTB、PRKG1、PLAUR等差异表达基因。(3)牛CSTB基因与羊的相似性最高,为97.96%,其次是猪;蛋白理化性质发现,CSTB含有98个氨基酸残基,不稳定系数为33.17(<40),为稳定蛋白;蛋白二级结构预测显示,CSTB主要是由延伸链和无规则卷曲构成;STRING在线数据库分析结果显示,CSTB可能与CTSH、WC1-10、CTSB等存在相互作用。[结论]本研究筛选出影响徐州牛肌肉不同嫩度的差异表达基因CSTB、VWF、DIRAS3、CDKN1A、CFB等。研究结果可为牛肉品质研究提供理论依据和数据支撑。

关键词：徐州牛背最长肌转录组测序肌肉嫩度

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MSTN基因编辑湖羊胫腓肌的转录组分析

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南京农业大学学报 2024年第2期47卷 342-350页

作者：李隐侠刘伟佳张晨俭舒嘉傲桂红兵王慧利孟春花张俊张建丽钱勇曹少先江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014

[目的]本文旨在探索肌肉抑制素基因(myostatin,MSTN)调控肌肉生长发育的分子机制。[方法]以3月龄MSTN基因编辑湖羊(试验组)和野生型湖羊(对照组)胫腓肌为对象,采用PCR和Western blot方法验证MSTN编辑湖羊编辑形式,在此基础上开展转录组... 详细信息

[目的]本文旨在探索肌肉抑制素基因(myostatin,MSTN)调控肌肉生长发育的分子机制。[方法]以3月龄MSTN基因编辑湖羊(试验组)和野生型湖羊(对照组)胫腓肌为对象,采用PCR和Western blot方法验证MSTN编辑湖羊编辑形式,在此基础上开展转录组测序和分析,并用real-time PCR方法对差异表达基因进行结果验证。[结果]对照组和试验组共有149个差异表达基因,其中65个基因上调,84个基因下调,GO注释和KEGG富集分析表明,差异表达基因显著富集在氧化磷酸化、果糖和甘露糖代谢、生热作用、FOXO和AMPK信号通路,表明MSTN基因可能通过以上信号通路参与湖羊生长发育调控。[结论]MSTN基因编辑湖羊可能通过FOXO和AMPK、氧化磷酸化、果糖和甘露糖代谢、生热作用等与动物代谢相关的信号通路调控其生长发育。

关键词：湖羊 MSTN基因 CRISPR/Cas9 转录组测序

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波尔山羊ACVRⅡB基因5′调控区多态性及其与初生体重体尺的关联分析

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畜牧与兽医 2023年第8期55卷 1-5页

作者：张晨俭李隐侠钱勇张俊孟春花王慧利仲跻峰曹少先江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014

旨在探讨波尔山羊激活素受体ⅡB(activin A receptor typeⅡB,ACVRⅡB)基因5′调控区多态性及其对初生体重体尺的影响。从103只波尔山羊耳组织中提取基因组DNA,扩增ACVRⅡB基因5′调控区序列,测序鉴定SNPs位点,分析遗传多态性,并与波尔... 详细信息

旨在探讨波尔山羊激活素受体ⅡB(activin A receptor typeⅡB,ACVRⅡB)基因5′调控区多态性及其对初生体重体尺的影响。从103只波尔山羊耳组织中提取基因组DNA,扩增ACVRⅡB基因5′调控区序列,测序鉴定SNPs位点,分析遗传多态性,并与波尔山羊初生体重、体尺进行关联分析。结果显示,鉴定到g.-1776C>G、g.-1725G>A、g.-1697C>T、g.-1604G>A、g.-1569G>C 5个SNPs位点,其中g.-1725G>A位点AA型在群体中频率为0.049,AG型为0.359,GG型为0.592,PIC为0.29,处于中度多态;g.-1569G>C位点CG型在群体中频率为0.167,GG型为0.833,PIC为0.14,处于低度多态。连锁分析发现g.-1725 G>A与g.-1697C>T、g.-1569G>C完全连锁(相关性为100%)。关联分析发现,g.-1725G>A位点AG型初生重、初生体长均显著高于GG型(P<0.05);g.-1569G>C位点CG型初生体高显著高于GG型。综上,g.-1725G>A位点可作为波尔山羊早期生长选育的候选分子标记。

关键词：波尔山羊 ACVRⅡB基因基因多态性初生体重初生体长

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Pladienolide B对牛胚胎干细胞多能性相关基因表达及细胞活力的影响

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中国农业科学 2023年第11期56卷 2186-2201页

作者：赵芳丁强夏淑雯高运东兰国成林志平王慧利仲跻峰江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室山东奥克斯畜牧种业有限公司香港大学李嘉诚医学院江苏优源奶业产业研究院有限公司

【背景】牛胚胎干细胞（bovine embryonic stem cells,BESCs）因具备较高的多能性，在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而，BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏，很多机制仍不清楚。【... 详细信息

【背景】牛胚胎干细胞（bovine embryonic stem cells,BESCs）因具备较高的多能性，在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而，BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏，很多机制仍不清楚。【目的】探究不同浓度Pladienolide B（PlaB）对BESCs多能标记基因、全能标记基因、胚胎细胞谱系基因表达及细胞活力的影响，为提高BESCs多能性提供参考和理论依据。【方法】利用免疫荧光检测牛BESCs多能标记基因的表达，利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）检测不同浓度PlaB对BESCs剪接体、全能标记基因及胚胎细胞谱系基因表达的影响，利用RT-qPCR和Western Blot分别检测不同浓度PlaB对BESCs多能标记基因mRNA和蛋白表达的影响，利用CCK8和EDU染色检测不同浓度PlaB对BESCs增殖的影响。【结果】RT-qPCR结果显示，PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1时显著下调EPSCM-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达水平；PlaB浓度为1.5nmol·L-1时，CTFR-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达下降；PlaB浓度范围为0.5—1.5 nmol·L-1时，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的SF3B4和SF3B5的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。此外，PlaB显著下调CTFR-BESCs中SF3B6的mRNA表达。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1时，EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接体LSM4的mRNA表达显著下调。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1时，显著下调CTFR-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平；PlaB浓度为1—1.5 nmol·L-1时能显著下调BEPSCM-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平。浓度为0.5—1.5 nmol·L-1范围内，PlaB均以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因OCT4、SOX2及NANOG的mRNA表达水平和蛋白水平。在PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1范围内，PlaB以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能标记基因MDM2、PID1及BTG2的mRNA表达水平，而下调DDIT4和PDRG1的mRNA表达水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上调胚胎细胞谱系基因的表达，而EPSCM-BESCs中添加PlaB显著降低GATA4、GATA6、SOX7等胚胎细胞谱系基因的表达，但是对于ZIC1没有显著影响。随着PlaB剂量增加和处理时间延长，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs细胞活力均呈下降趋势，但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【结论】PlaB显著上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因和部分全能标记基因的表达；降低EPSCM-BESCs中胚胎细胞谱系基因的表达和细胞活力。PlaB对两种BESCs发挥作用的浓度及对基因表达的影响并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的细胞活力，仍需要进一步研究以优化培养体系。

关键词：牛胚胎干细胞 Pladienolide B 剪接体多能性相关基因细胞活力

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利用胞嘧啶碱基编辑器高效制备奶牛BLG基因敲除胚胎的研究

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南京农业大学学报 2024年第6期47卷 1159-1167页

作者：丁修虎丁强王悦夏淑雯赵芳陈坤琳吴家顺何南仲跻峰王慧利李惠侠南京农业大学动物科技学院江苏南京210095 江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方... 详细信息

[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c^(*).61 C>T(p.Q21^(*))的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中,收集囊胚,分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚,进行胚胎基因组PCR扩增,扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列,全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]囊胚靶向编辑效率检测结果表明,YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为83.3%(20/24)高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%(12/20),而前者存在较大的编辑窗口(C1-C9),可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑,后者具有较小的编辑窗口C2-C4;另外,YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%(7/20),而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑,纯合编辑率较低;2种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的2种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎,为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。

关键词：单碱基编辑奶牛 BLG基因胚胎

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牛miR-17~92基因簇在牛睾丸中的表达及其生物学功能分析

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中国畜牧杂志 2024年第10期60卷 120-127页

作者：丁强丁修虎夏淑雯仲跻峰王慧利江苏省农业科学院畜牧研究所江苏省畜禽精准育种工程研究中心农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014 南京农业大学动物科技学院江苏南京210095

牛miR-17~92基因簇由6个不同的功能miRNAs组成,参与牛睾丸发育与精子发生。本研究从牛基因组中获得miR-17~92基因簇序列信息进行物种保守性分析,再采用半定量PCR的方法检测miR-17~92基因簇前体miRNA在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾及不... 详细信息

牛miR-17~92基因簇由6个不同的功能miRNAs组成,参与牛睾丸发育与精子发生。本研究从牛基因组中获得miR-17~92基因簇序列信息进行物种保守性分析,再采用半定量PCR的方法检测miR-17~92基因簇前体miRNA在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾及不同活力精子中的表达水平,利用miWalk、TargetScan 7.2及miRTarBase 8.0等在线网站预测成熟miRNA的靶基因,并利用KOBAS3.0对预测靶基因进行GO和KEGG通路分析。结果表明,牛miR-17~92基因簇在哺乳动物进化中具有保守性,该基因簇的6个miRNA前体在睾丸组织中呈现高表达,均显著高于附睾组织;而这6个miRNA前体在附睾的不同位置也具有表达差异,其中pre-miR-19a在附睾尾中表达显著高于附睾体和附睾头,pre-miR17和pre-miR20a在附睾中未检测到表达;在不同活力精子中,高活力精子的bta-miR-17-5p、bta-miR-18、bta-miR-20a的表达水平显著高于低活力精子;生物信息学分析结果表明,6个miRNA一共预测到2 940个靶基因,这些靶基因主要通过MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路等参与调控牛睾丸功能。本研究分析了miR-17~92基因簇在牛睾丸中的表达分布,为miR-17~92基因簇对牛睾丸发育和调控精子活力的作用机制研究提供参考依据。

关键词：牛睾丸附睾 miR-17~92基因簇

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CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 129-141页

作者：张晨俭李隐侠丁强刘伟佳王慧利何南吴家顺曹少先南京农业大学动物科技学院南京210095 江苏省农业科学院畜牧研究所江苏省畜禽精准育种工程研究中心农业农村部种养结合重点实验室南京210014 山东农业大学动物科技学院泰安271017

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体... 详细信息

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

关键词：山羊胚胎细胞因子信号传导抑制因子2 CRISPR/Cas9 基因编辑

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