检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2020年第9期33卷 1014-1018,1022页

作者：李明洋魏荷婷陈天枫胡瑜沈玉婷董海艳朱珊丽张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035 温州医科大学精神医学学院浙江温州325035 温州医科大学仁济学院浙江温州325035

目的制备E型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)多克隆抗体,并在体外检测其生物学特性。方法通过分子克隆方法构建重组表达质粒pET21a(+)/MOMP,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达重组MOMP蛋白,经镍螯合亲和层析胶纯化后,经皮下多点注射免疫日本大耳白兔,制备兔多克隆抗体,分别采用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。在HeLa细胞中培养E血清型Ct,通过卢戈和吉姆萨染色法观察细胞中Ct包涵体的形成情况,间接免疫荧光法检测制备的MOMP多克隆抗体对Ct天然MOMP的结合特异性。结果Ct MOMP可在原核表达系统中高效表达;制备的兔抗MOMP多克隆抗体ELISA效价可达1∶256000,可特异性结合、识别融合及天然的Ct MOMP。结论制备的兔抗Ct MOMP多克隆抗体效价高、特异性强,为后续进一步研究Ct的致病机制及开发新的免疫诊断制剂奠定了基础。

关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体

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新型冠状病毒S蛋白B细胞表位的预测与分析

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温州医科大学学报 2020年第3期50卷 173-176页

作者：朱珊丽丁宁项丹董海艳薛向阳张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所浙江温州325035

目的:分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S刺突蛋白的二级结构并预测其可能的B细胞表位。方法:基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列,分别采用SOPMA、GOR方法预测S蛋白的二级结构,并结合其跨膜区、亲水性、表面可及性和抗原性参数等综合分析,预测S... 详细信息

目的:分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S刺突蛋白的二级结构并预测其可能的B细胞表位。方法:基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列,分别采用SOPMA、GOR方法预测S蛋白的二级结构,并结合其跨膜区、亲水性、表面可及性和抗原性参数等综合分析,预测SARS-CoV-2 S蛋白可能的B细胞表位。结果:对SARS-CoV-2 S蛋白二级结构的预测表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。多种参数综合分析推测,其可能的优势B细胞表位位于354~360、437~445、454~471、527~537、567~582、678~685、772~779和806~818位氨基酸。结论:采用多参数预测SARS-CoV-2 S蛋白的B细胞表位,为深入研究S蛋白的功能奠定基础。

关键词：新型冠状病毒 S蛋白 B细胞表位预测

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人巨细胞病毒US31蛋白的特异性抗体的制备及鉴定

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中国卫生检验杂志 2020年第17期30卷 2102-2105,2108页

作者：李宝青项超丽谢尚丹施昕妤郭刚强薛向阳温州医科大学附属第二医院浙江温州325000 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325000 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所浙江温州325000

目的制备人巨细胞病毒(HCMV)US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG... 详细信息

目的制备人巨细胞病毒(HCMV)US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经镍柱亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的Ig G抗体,效价为1∶49600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：人巨细胞病毒 US31蛋白多克隆抗体

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DAXX在胃癌中的表达定位及其小泛素化修饰对胃癌恶性表型的影响

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温州医科大学学报 2020年第10期50卷 775-781页

作者：陈琛斌黄群佳谢旺凯徐剑峰沈贤薛向阳赵志光温州医科大学附属第二医院育英儿童医院胃肠外科浙江温州325027 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院病理科浙江温州325027 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所浙江温州325035

目的:研究死亡结构域相关蛋白(DAXX)在胃癌中的表达与定位,并探讨小泛素化修饰(SUMO)的DAXX对胃癌细胞恶性表型的影响。方法:生物信息学分析肿瘤基因图谱(TCGA)计划中DAXX在胃癌中的表达与预后;RT-qPCR检测各胃癌细胞系中DAXX的mRNA水... 详细信息

目的:研究死亡结构域相关蛋白(DAXX)在胃癌中的表达与定位,并探讨小泛素化修饰(SUMO)的DAXX对胃癌细胞恶性表型的影响。方法:生物信息学分析肿瘤基因图谱(TCGA)计划中DAXX在胃癌中的表达与预后;RT-qPCR检测各胃癌细胞系中DAXX的mRNA水平。收集2017年1月至6月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院胃癌术后患者20对癌和癌旁组织,免疫组化检测DAXX的表达。CCK-8和划痕实验分别检测DAXX对细胞增殖和迁移的作用。Western blot检测DAXX的核-浆蛋白分布及其对SUMO-2/3的影响。结果:生物信息学分析显示,DAXX在胃癌中的表达水平高于癌旁组织,但其表达高低对患者生存预后无影响(P=0.52);免疫组化结果显示胃癌组织DAXX的阳性率高于癌旁,且在细胞核中高表达;RT-qPCR证实胃癌细胞系中DAXX的mRNA表达量升高。CCK-8和划痕实验提示DAXX明显抑制细胞增殖(P<0.05)并促进细胞迁移(P<0.01)。Western blot显示DAXX核-浆蛋白分布差异,且存在SUMO-2/3修饰。结论:DAXX在胃癌组织中高表达,且主要定位于细胞核。DAXX可能通过与SUMO-2/3结合,抑制胃癌增殖和促进转移。

关键词：死亡结构域相关蛋白胃癌小泛素化修饰亚细胞定位

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小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性

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温州医科大学学报 2018年第6期48卷 401-407,412页

作者：吕开绩陈旭东程开王路得朱进顺 Kamara Saidu 张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核... 详细信息

目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核表达系统制备相应的重组蛋白并纯化,通过Western blot进行鉴定;将纯化的mPD-L1蛋白免疫健康日本大耳白兔制备兔多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot分析得到的多克隆抗体的效价和特异性,并且将该多克隆抗体作为免疫荧光的阳性对照。最后应用ELISA和免疫荧光验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的亲和性。结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示原核表达的重组蛋白与预期大小一致,mPD-L1和mPD-1分别为25 kDa和40 kDa。经mPD-L1蛋白免疫后的日本大耳白兔能够产生特异性抗体,抗体效价在免疫后第6周达到高峰,Western blot检测结果显示多克隆血清可特异性识别mPD-1。ELISA结果表明,原核表达的mPD-L1蛋白能够和mPD-1蛋白结合,实验组OD450值明显高于对照组。免疫荧光结果显示,在小鼠PD-L1阳性细胞B16(小鼠黑色素瘤细胞株)的胞膜区出现绿色荧光团块。结论:利用原核细胞表达并纯化后获得mPD-L1和mPD-1蛋白,并在体外成功验证了mPD-L1和mPD-1之间的结合特性,为后期利用mPD-1和PD-L1的生物学特性研究提供了基础。

关键词： mPD-1 mPD-L1 原核表达干扰素 ELISA 免疫荧光小鼠

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程序性死亡受体配体-1 B细胞表位预测与分析

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温州医科大学学报 2018年第1期48卷 7-12,19页

作者：陈旭东程开吕开绩张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zim... 详细信息

目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等,结合PD-L1的二级结构与其柔性区域对PD-L1的优势B细胞表位区段进行综合分析,建立3D模型,结合功能定位,进一步运用抗原指数分析预测,将人与小鼠的B细胞表位进行对比分析,并与多种实验动物进行同源性分析。结果:人和小鼠的PD-L1均为一型跨膜蛋白,均由290个氨基酸残基组成,相对分子质量均为33 kDa。人和小鼠PD-L1的胞外段分别位于N端的19~238和19~239。经综合分析,与PD-1、PDL1结合相关的人和小鼠的B细胞优势表位可能分别位于其氨基酸序列N端的41~46、60~63、71~75和40~48、58~63、72~88区段,即KFPVEK、EDKN、EEDLK和RFPVERELDL、EKEDE、EDLKPQH肽段;同源性分析显示包含本研究所预测的表位的氨基酸序列在多种动物之间高度保守。结论:将生物信息学预测B细胞表位的方法与3D模型建立及功能定位的方法相结合,筛选出人和鼠各3条与PD-L1功能区相近的优势B表位,为阻断PD-1和PD-L1结合的拮抗剂的研究提供了理论基础。

关键词：程序性死亡受体配体-1 B细胞表位肿瘤免疫疗法

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PD-L2蛋白B细胞表位预测及其与PD-1结合的三维结构分析

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温州医科大学学报 2018年第5期48卷 319-324,329页

作者：程开陈旭东吕开绩金劲激叶晓鲜张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和J... 详细信息

目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和Jameson-Wolf抗原指数以及Emini表面可及性方案等,预测结果被用以对PD-L2的优势B细胞表位区段进行多方面分析。运用抗原指数分析,预测PD-L2的B细胞表位。使用BLAST分析人源PD-L2与小鼠PD-L2的同源性,将人源PD-L2的B表位与小鼠PD-L2的序列进行匹配。将与人源PD-L2表位匹配的序列在小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合模型上定位,对其立体结构进行模拟,进一步直观地分析B细胞表位与蛋白结合位点的关系。结果:PD-L2的全长氨基酸序列共含有273个氨基酸,相对分子质量为31 k Da的可溶性蛋白;经综合分析,其B细胞优势表位可能为氨基酸序列N端的60~72、93~97、133~139、164~171区段。模拟立体结构分析显示表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PDL2的结合区域内。结论:利用生物信息学预测发现PD-L2的优势B细胞表位中,60~72、93~97、133~139、164~171区段为PD-L2的B细胞表位,其中表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PD-L2的结合区域内。可为PD-L2抗体设计和研究提供理论基础。

关键词：程序性死亡因子1 程序性死亡因子配体2 B细胞表位立体结构

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人巨细胞病毒UL138基因表达对胃癌细胞免疫相关功能的影响

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温州医科大学学报 2018年第7期48卷 474-478页

作者：叶乐乐张佳丽陈文静沈贤胡畅远丁宁薛向阳温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所浙江温州325035 温州医科大学仁济学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院胃肠外科浙江温州325027

目的:探讨人巨细胞病毒UL138基因表达对胃癌细胞免疫相关功能的影响。方法:构建UL138基因真核表达重组质粒,转染BGC-823胃癌细胞,经Westernblot及免疫荧光验证UL138表达,通过基因芯片结合生物信息学技术分析UL138表达对胃癌细胞功能的影... 详细信息

目的:探讨人巨细胞病毒UL138基因表达对胃癌细胞免疫相关功能的影响。方法:构建UL138基因真核表达重组质粒,转染BGC-823胃癌细胞,经Westernblot及免疫荧光验证UL138表达,通过基因芯片结合生物信息学技术分析UL138表达对胃癌细胞功能的影响,荧光定量PCR进一步验证胃癌细胞中免疫相关分子的表达,Westernblot分析免疫原性死亡相关蛋白的变化。结果:Westernblot及免疫荧光证实重组质粒转染后胃癌细胞表达UL138;基因芯片差异基因分析显示UL138的表达上调了370个基因表达,下调了206个基因的表达;生物信息学分析提示这些差异基因的表达参与了胃癌细胞骨架重构、细胞黏附等并与消化系统疾病相关。荧光定量PCR分析显示UL138的表达上调了IL1A、IL6、IL11、IL8、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD27416种炎症相关细胞因子基因表达并下调了CXCL10、IFNAR1基因的表达。此外,Westernblot结果显示UL138的表达上调了免疫原性死亡相关蛋白ERp57的表达(P<0.01),不影响HSP70的表达(P>0.05)。结论:UL138基因的表达能促进胃癌细胞促炎相关细胞因子表达并诱导免疫原性细胞死亡的特征。

关键词：胃肿瘤巨细胞病毒 UL138 细胞因子类

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MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用

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温州医科大学学报 2017年第5期47卷 318-324页

作者：蔡一奇程开陈旭东陈孝冬岑丹维张婵琼宋易玲毛姗姗叶晓鲜张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,... 详细信息

目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性。结果:成功构建重组质粒pET21a(+)/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白。SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48 k Da,与预期蛋白大小一致,并以His单抗进行Western blot鉴定,出现了特异性的单一条带。MAGEA3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Western blot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单一条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375(黑色素瘤细胞株)和SGC-7901细胞(胃癌细胞株)的胞浆内出现荧光团块。表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白。结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆Ig G抗体效价可达1:40 000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白。结论:通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原。

关键词：人黑色素瘤抗原A3 原核表达系统多克隆抗体胃肿瘤

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趋化因子CXCL14在SLE患者外周血单个核细胞中的表达及启动子甲基化分析

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中国应用生理学杂志 2017年第3期33卷 197-201页

作者：王金丹黄茜茜叶璐璐范超凡郭刚强徐玲娟薛向阳盛秀胜温州医科大学检验医学院、生命科学院浙江温州325035 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325035 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所浙江温州325035 金华市中医医院检验科浙江金华321017 金华职业技术学院医学院浙江金华321017

目的:分析趋化因子CXCL14在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其启动子甲基化特征。方法:收集28例SLE患者和20名健康人外周血单个核细胞(PBMC)标本,抽提细胞中RNA,逆转录后,以GAPDH为内参,通过定量PCR检测PBMC中... 详细信息

目的:分析趋化因子CXCL14在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其启动子甲基化特征。方法:收集28例SLE患者和20名健康人外周血单个核细胞(PBMC)标本,抽提细胞中RNA,逆转录后,以GAPDH为内参,通过定量PCR检测PBMC中CXCL14的表达,统计分析CXCL14表达水平与SLE各种临床资料的相关性,探讨PBMC中CXCL14表达与SLE的关系,通过重亚硫酸盐修饰的全基因组DNA用以BSP测序来明确不同标本中CXCL14启动子中甲基化位点的甲基化率。结果:CXCL14在SLE患者和正常人PBMC中的表达量存在显著差异(P<0.05)。与健康人PBMC中CXCL14的含量相比较,CXCL14在SLE患者PBMC中表达量显著降低。与进一步CXCL14表达水平与SLE各种临床资料的相关性分析显示,CXCL14表达水平与SSB抗体(干燥综合征B抗体)、蛋白尿及血小板计数相关。与SSB抗体阴性SLE患者比较,SSB抗体阳性患者CXCL14表达水平更低(P<0.05);与蛋白尿阴性SLE患者相比,蛋白尿阳性患者CXCL14表达水平更低(P<0.05);而血小板升高患者的CXCL14表达水平更高(P<0.05)。CXCL14表达水平与SLE活动、肾损害指标、抗ds-DNA、C反应蛋白(CRP)、补体C3水平等指标未见显著相关性。CXCL14启动子区甲基化分析显示,SLE患者Cp G岛甲基化明显高于正常对照。结论:PBMC中低表达的CXCL14与SLE发生发展相关,其启动子区Cp G岛过度甲基化是SLE患者CXCL14低表达的重要机制。

关键词：系统性红斑狼疮趋化因子 CXCL14 甲基化

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