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第三军医大学学报 2019年第10期41卷 907-912页

作者：刘汨谢杨丽黄俊兰张若彬孙先定蒋宛凌陈涵纲倪振洪张斌陈林杜晓兰陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院野战外科研究所战创伤康复医学研究室创伤实验室骨代谢与修复中心创伤烧伤与复合伤国家重点实验室全军军事训练伤防治与康复实验室重庆400042

目的探讨低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS)对体外培养软骨细胞活性、增殖、分化和凋亡以及骨组织生长的影响。方法分离新生3～5 d C57BL/6J小鼠的软骨细胞和胚胎期18.5 d小鼠跖骨,分为对照组(未处理组)及3种LIPU... 详细信息

目的探讨低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS)对体外培养软骨细胞活性、增殖、分化和凋亡以及骨组织生长的影响。方法分离新生3～5 d C57BL/6J小鼠的软骨细胞和胚胎期18.5 d小鼠跖骨,分为对照组(未处理组)及3种LIPUS处理组,其声强度和占空比的参数为:LIPUSⅠ,30 mW/cm^2-20%;LIPUSⅡ,30 mW/cm^2-40%;LIPUSⅢ,50 mW/cm^2-20%;其余参数为:中心频率1.5 MHz,脉冲重复频率1 KHz,处理时间20 min/d;分别用CCK-8、EdU掺入及TUNEL检测软骨细胞的活性变化、增殖、凋亡;定量RT-PCR检测蛋白聚糖(Aggrecan,Acan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型胶原(CollagenⅩ,ColⅩ)等软骨基质相关基因表达;采集图像后测量跖骨长度,计算跖骨全长增长率、软骨增长率。结果 3种参数的LIPUS处理能促进软骨细胞的活性和增殖,抑制软骨细胞凋亡,其中LIPUSⅡ组效果最明显;定量RT-PCR结果显示:各处理组软骨细胞的Acan、ColⅡ的mRNA表达均较对照组明显增高,ColⅩ表达降低(P<0.05);跖骨长度计算结果显示:LIPUSⅡ、Ⅲ组软骨和全长增长率均显著高于对照组(P<0.01),而LIPUSⅠ组与对照组无明显差异。结论 LIPUS可能通过促进软骨细胞活性、增殖以及细胞外基质合成,抑制细胞凋亡,加快骨组织生长,且效果与超声参数有关;其中声强度30 mW/cm^2、占空比40%的LIPUS作用最明显。

关键词：低强度脉冲超声强度占空比软骨细胞骨培养小鼠

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不同强度的低强度脉冲超声波对椎间盘退变的影响

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第三军医大学学报 2018年第22期40卷 2027-2033页

作者：蒋宛凌黄俊兰谭乔燕张若彬李灿谢杨丽李芳芳许萌刘汨杜晓兰陈林陆军军医大学第三军医大学第三附属医院(野战外科研究所)战创伤康复研究室、创伤实验室、骨代谢与修复中心、创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042 陆军军医大学(第三军医大学)第三附属医院(野战外科研究所)康复医学科重庆400042

目的探讨不同强度的低强度脉冲超声波对椎间盘退变的影响,筛选低强度脉冲超声波的最佳治疗强度。方法采用3种强度（0. 1、0. 5、1. 0 W/cm^2）的低强度脉冲超声波处理大鼠髓核细胞及筛选的最佳强度超声波处理针刺椎间盘模型小鼠; EdU... 详细信息

目的探讨不同强度的低强度脉冲超声波对椎间盘退变的影响,筛选低强度脉冲超声波的最佳治疗强度。方法采用3种强度（0. 1、0. 5、1. 0 W/cm^2）的低强度脉冲超声波处理大鼠髓核细胞及筛选的最佳强度超声波处理针刺椎间盘模型小鼠; EdU检测髓核细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,定量PCR检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、波形蛋白等相关基因表达;组织学分析小鼠尾部椎间盘退变程度。结果 3种强度的低强度脉冲超声波能促进髓核细胞增殖及迁移,强度为0. 5 W/cm^2及1. 0 W/cm^2的低强度脉冲超声波作用较明显（P 〈0. 01）。低强度脉冲超声波也可上调正常环境及炎症刺激下髓核细胞中蛋白聚糖、波形蛋白等表达,其中强度为0. 5 W/cm^2、频率为3 MHz、占空比为50%中强度的低强度脉冲超声波作用最强（P 〈0. 01）。对照组小鼠椎间盘表现出明显退变表型,而超声组椎间盘退变程度的组织评分明显低于对照组（P 〈0. 01）。结论低强度脉冲超声波可能通过上调椎间盘的蛋白聚糖、波形蛋白、Ⅱ型胶原表达,加快细胞增殖及迁移等,对椎间盘退变有一定防治作用,其中强度为0. 5 W/cm^2、频率为3 MHz、占空比为50%中强度的低强度脉冲超声波作用最明显。

关键词：低强度脉冲超声波强度椎间盘退变髓核小鼠

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成纤维细胞生长因子抑制长链非编码RNA Malat1的表达及对软骨细胞增殖的影响

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第三军医大学学报 2017年第10期39卷 946-953页

作者：郭静远王权温轩谭乔燕谢杨丽苏楠陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢与修复中心创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的探讨在软骨细胞模型中成纤维细胞生长因子通路对长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)Malat1的调控作用。方法采用Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 1,Fgfr1)组织特异性敲除小鼠和Ⅲ型成纤维细... 详细信息

目的探讨在软骨细胞模型中成纤维细胞生长因子通路对长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)Malat1的调控作用。方法采用Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 1,Fgfr1)组织特异性敲除小鼠和Ⅲ型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 3,Fgfr3)敲除小鼠的原代软骨,以及利用软骨细胞系培养充当软骨细胞模型,成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)及下游细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路阻断剂U0126处理细胞,利用荧光定量PCR检测Malat1的表达变化。在ATDC5细胞模型中通过siRNA转染干扰Malat1或Fgfr1,质粒转染过表达Fgfr1,利用荧光定量PCR检测Malat1的表达,细胞计数检测细胞增殖变化。结果 Malat1被干扰24、36、48、60 h后,ATDC5细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),FGF2处理ATDC5细胞24 h后Malat1表达显著下降(P<0.05),且ERK通路抑制剂U0126处理细胞后FGF2对Malat1的抑制作用消失。Fgfr1条件性敲除或si-Fgfr1干扰后Malat1表达显著升高(P<0.05),且FGF2对Malat1的抑制作用消失,Fgfr1在ATDC5细胞中过表达后Malat1表达与对照组相比显著降低(P<0.05)。结论软骨细胞中FGF2可能通过Fgfr1激活下游ERK通路,抑制了Malat1的表达,从而影响软骨细胞增殖。

关键词：长链非编码RNA Malat1 成纤维细胞生长因子软骨细胞增殖

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骨培养探讨脂多糖对小鼠骨骼发育及矿化的影响

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第三军医大学学报 2016年第11期38卷 1235-1239页

作者：孙珂媛杨京谢杨丽徐伟王权杜晓兰陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢修复中心创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042 第三军医大学大坪医院野战外科研究所康复科重庆400042

目的探讨体外培养情况下脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激对小鼠骨骼发育和矿化的影响及其机制。方法分离E18.5 d小鼠跖骨和胫骨,分为空白对照组(Blank组)及LPS组(10μg/m L LPS)。分别于培养后第1、7天照相,计算跖骨和胫骨全长增长... 详细信息

目的探讨体外培养情况下脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激对小鼠骨骼发育和矿化的影响及其机制。方法分离E18.5 d小鼠跖骨和胫骨,分为空白对照组(Blank组)及LPS组(10μg/m L LPS)。分别于培养后第1、7天照相,计算跖骨和胫骨全长增长率(TL-rate)、矿化带增长率(CZ-rate)、第7天矿化带占骨全长的比例(CZ%)。培养7 d后固定、石蜡包埋切片,臧红固绿和甲苯胺蓝染色观察肥大带宽度、Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型胶原(collagenⅩ,ColⅩ)免疫组化染色观察软骨细胞分化及TUNEL染色观察软骨细胞凋亡变化。结果与Blank组比较,LPS处理后跖骨和胫骨TL-rate及CZ-rate明显降低(跖骨TL-rate P=0.025;跖骨CZ-rate P=0.019;胫骨TL-rate P=0.010;胫骨CZ-rate P=0.024)。臧红固绿、甲苯胺蓝染色及形态计量显示LPS组胫骨肥大带较Blank组明显变短(P<0.001)。与Blank组比较,LPS组胫骨的软骨分化相关蛋白ColⅡ、ColⅩ表达降低,软骨细胞凋亡明显增加。结论 LPS通过抑制软骨增生、分化及促进肥大带软骨细胞凋亡来抑制骨骼发育及矿化。

关键词： LPS 骨培养骨发育骨矿化小鼠

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改良盲肠结扎穿孔术模型对生存率的影响

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中华实验外科杂志 2016年第11期33卷 2597-2598页

作者：唐玉彬井丽君苏楠杜晓兰陈林兰州军区兰州总医院急诊科 730050 第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢修复中心创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的对原有盲肠结扎穿孔术（CLP）模型进行改良,使其操作更简便,重复性和一致性更好.方法用小鼠盲肠分支血管位置作为盲肠结扎位置的标准,将CLP模型分为轻、中、重3组,对比观察不同严重程度组别小鼠生存率.增加液体复苏和广谱抗生素... 详细信息

目的对原有盲肠结扎穿孔术（CLP）模型进行改良,使其操作更简便,重复性和一致性更好.方法用小鼠盲肠分支血管位置作为盲肠结扎位置的标准,将CLP模型分为轻、中、重3组,对比观察不同严重程度组别小鼠生存率.增加液体复苏和广谱抗生素处理因素,观察对重度CLP模型生存率影响.结果对照组和轻度组72 h生存率为100％,中度组72 h生存率为70％,重度组40h生存率为0.复苏组和抗生素组的全部死亡时间分别为44h和46h,与重度CLP组比较差异无统计学意义（P＜0.05）.结论该方法改良CLP模型,可获得不同严重程度表现,操作简便,可重复性和一致性好.液体复苏和广谱抗生素不能明显改变重度CLP模型小鼠生存率.

关键词：盲肠结扎穿孔术改良生存率

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FGFR3在成年期小鼠颞下颌关节稳态维持中的作用研究

FGFR3在成年期小鼠颞下颌关节稳态维持中的作用研究

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2016第四届“模式生物与人类健康”发育遗传学峰会

作者：周思儒第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢修复中心创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室

颞下颌关节骨性关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)是一种成年人的常见软骨退行性疾病,其病理特征表现为关节软骨的进行性丢失.成纤维生长因子受体3(Fibroblast Growth Factor Receptor3,FGFR3)信号在调控骨骼发育... 详细信息

颞下颌关节骨性关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)是一种成年人的常见软骨退行性疾病,其病理特征表现为关节软骨的进行性丢失.成纤维生长因子受体3(Fibroblast Growth Factor Receptor3,FGFR3)信号在调控骨骼发育与维持骨骼稳态方面起着重要作用,然而其在颞下颌关节软骨稳态维持中的作用至今尚未清楚.本研究观察了小鼠成年期软骨细胞内敲除FGFR3对颗下领关节软骨稳态的影响。关节软骨稳态的影响。在2月龄Fgfr3f/f;Co12a1-CreERT2 (Fgfr3 cKO)小鼠诱导敲除FGFR3后，其颗下领关节表现为典型的OA样病理改变。Fgfr3 cKO小鼠颗下领关节软骨中Collagen X, MMP13和ADAMTS 5等OA标志物的表达水平显著性上调。此外，Fgfr3 cKO小鼠关节软骨表面的润滑分子lubricin表达水平显著性下降，并伴随软骨细胞凋亡显著性增多。

关键词：骨性关节炎颞下颌关节病理机制成纤维生长因子受体3 软骨稳态

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成年小鼠骨细胞的分离鉴定及其成纤维细胞生长因子受体的表达

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第三军医大学学报 2015年第8期37卷 718-722页

作者：唐玉彬苏楠温轩陈思宇杜晓兰陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所:创伤实验室骨代谢修复中心创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆340004 兰州军区兰州总医院急诊科兰州730050 第三军医大学大坪医院野战外科研究所康复科重庆340004

目的建立稳定的成年小鼠骨细胞分离和鉴定方法,检测其标志性基因和成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）表达。方法将3月龄C57小鼠的胫骨和股骨分离后剪除干骺端,冲去骨髓,切割成约1 mm碎片,用Ⅰ型胶原酶... 详细信息

目的建立稳定的成年小鼠骨细胞分离和鉴定方法,检测其标志性基因和成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）表达。方法将3月龄C57小鼠的胫骨和股骨分离后剪除干骺端,冲去骨髓,切割成约1 mm碎片,用Ⅰ型胶原酶和EDTA溶液交替消化以获取骨细胞。分别通过形态观察、ALP染色、OC染色和E11/gp38染色鉴定骨细胞。qRT-PCR检测骨细胞标志性基因表达,并与骨细胞系IDG-SW3和MLO-Y4比较。检测FGFRs在骨细胞的表达。结果分离出的骨细胞呈多树突状或星状,并借突触彼此连接。ALP染色可见成骨细胞染色阳性,骨细胞染色阴性。OC染色成骨细胞和骨细胞均阳性,成纤维细胞阴性,而E11/gp38染色仅见骨细胞染色阳性。实验所得细胞表达骨细胞特异基因DMP1、SOST、FGF23,表明骨细胞成功分离,且此原代骨细胞与IDG-SW3和MLOY4细胞系表达有差异。FGFR1-3在骨细胞中均有表达。结论成功分离成年小鼠原代骨细胞,发现FGFR1-3在原代骨细胞中均有表达。

关键词：骨细胞细胞分离成纤维细胞生长因子受体

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维生素D信号通路在骨骼稳态维持中的作用

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中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 2015年第2期8卷 156-163页

作者：黄启钊戚华兵杜晓兰陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢修复中心创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042 第三军医大学大坪医院康复理疗科重庆400042

维生素D作为一种重要的类固醇激素在骨骼发育和稳态维持中发挥重要作用。机体从外界获取的维生素D需在体内经过2次羟化转变为活性1,25-二羟基维生素D3,然后与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后发挥生物学作用。传统观点认为1,... 详细信息

维生素D作为一种重要的类固醇激素在骨骼发育和稳态维持中发挥重要作用。机体从外界获取的维生素D需在体内经过2次羟化转变为活性1,25-二羟基维生素D3,然后与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后发挥生物学作用。传统观点认为1,25-二羟基维生素D3在体内主要通过内分泌途径作用于肠道和肾脏,通过调节钙磷吸收和重吸收维持矿物质稳态,并因此间接调节骨骼稳态。近年发现1,25-二羟基维生素D3能直接作用于成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞等,通过调节其增殖、分化直接调节骨形成与骨吸收,维持骨稳态的平衡。

关键词：维生素D 1,25-二羟基维生素D3 骨稳态

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一例Ⅱ型常染色体显性骨硬化症患者氯离子通道蛋白7基因突变分析

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中华医学遗传学杂志 2014年第5期31卷 612-614页

作者：李晓刚苏楠李灿杨京杜晓兰陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室、骨代谢与修复中心、创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的检测1例Ⅱ型常染色体显性骨硬化症患者氯离子通道7（chloride channel7，CLCN7）基因的突变情况，探讨其分子发病机制。方法收集1例骨硬化症患者及100名健康成年人的血液标本，提取基因组DNA，PCR扩增CLCN7基因外显子并对所有外显... 详细信息

目的检测1例Ⅱ型常染色体显性骨硬化症患者氯离子通道7（chloride channel7，CLCN7）基因的突变情况，探讨其分子发病机制。方法收集1例骨硬化症患者及100名健康成年人的血液标本，提取基因组DNA，PCR扩增CLCN7基因外显子并对所有外显子及其旁侧内含子序列进行DNA测序分析。结果患者CLCN7基因第25外显子存在c．2460delA缺失突变，导致CLCN7基因784位及其后所有密码子移码突变（Arg784GlyfsX29）。该突变为一新突变，正常人均未检测到该突变。结论CLCN7基因Arg784GlyfsX29移码突变是导致该骨硬化症患者发病的原因。

关键词： Ⅱ型常染色体显性遗传性骨硬化症氯离子通道7基因基因突变

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细胞谱系示踪技术

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生理科学进展 2014年第5期45卷 379-384页

作者：李晓刚苏楠杜晓兰陈林第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室骨代谢与修复中心创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室第三军医大学大坪医院康复理疗科重庆400042

细胞谱系示踪(cell lineage tracing)是指利用各种方式标记细胞,并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。自20世纪以来,谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些... 详细信息

细胞谱系示踪(cell lineage tracing)是指利用各种方式标记细胞,并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。自20世纪以来,谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些年,随着基因工程技术的飞速发展,细胞谱系示踪技术也有所突破,尤其是诱导性重组酶Cre/loxp系统的应用,极大地拓宽了细胞谱系示踪技术的应用范围。本文将结合细胞谱系示踪技术在多种研究中的应用,对该技术的原理、特点以及最新进展做一综述。

关键词：谱系示踪基因打靶活体示踪

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