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第三军医大学学报 2007年第9期29卷 817-819页

作者：彭旭袁顺宗王晓娟甘成军王庆红陈烯伟张小容胡晓红罗高兴吴军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038

目的原核表达人HT036蛋白并鉴定其正确性。方法采用PCR技术,扩增人HT036蛋白编码序列,克隆至原核表达载体pET30a(+)中,用IPTG诱导表达,免疫印迹鉴定。结果PCR扩增得到了目的DNA片段,克隆至原核表达载体后经酶切与测序鉴定正确,并在大肠... 详细信息

目的原核表达人HT036蛋白并鉴定其正确性。方法采用PCR技术,扩增人HT036蛋白编码序列,克隆至原核表达载体pET30a(+)中,用IPTG诱导表达,免疫印迹鉴定。结果PCR扩增得到了目的DNA片段,克隆至原核表达载体后经酶切与测序鉴定正确,并在大肠杆菌中获得高效表达,用抗His抗体鉴定融合蛋白表达正确。结论成功构建了重组原核表达载体并正确表达了HT036蛋白。

关键词： HT036蛋白原核表达增生性瘢痕

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荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用

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第三军医大学学报 2007年第16期29卷 1555-1558页

作者：袁顺宗谭江琳彭旭马兵曹红卫贺伟峰陈希炜易绍萱胡晓红张小容罗高兴吴军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038 第三军医大学西南医院综合实验研究中心重庆400038

目的利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用。方法分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的... 详细信息

目的利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用。方法分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R)。结果重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3nm。结论成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用。

关键词： ITGB4BP P311 荧光共振能量转移蛋白相互作用

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腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

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第三军医大学学报 2007年第9期29卷 810-813页

作者：石东文代飞陈希炜贺伟峰胡晓红罗高兴吴军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038 第三军医大学西南医院骨科全军矫形外科中心重庆400038

目的通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrowmesenchymal stem cells,hM-SCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响。方法采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转... 详细信息

目的通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrowmesenchymal stem cells,hM-SCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响。方法采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测。结果分离培养的hMSCs CD105表达阳性,CD34表达阴性。重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hM-SCs的转染率为81.14%,CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好。免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积。结论腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究。

关键词： hMSCs CTLA-4Ig 基因转染诱导成骨

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突变的SOD1 cDNA与人MAP/MARK1片段在人胚肾293细胞中的相互作用

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第三军医大学学报 2007年第24期29卷 2327-2329页

作者：陈桂生史树贵李露斯陈康宁袁顺宗彭旭吴军罗高兴第三军医大学西南医院神经内科重庆400038 第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038

目的用酵母双杂交方法显示突变的SOD1cDNA与人MAP/MARK1的片段结合,进一步探讨二者能否在哺乳动物表达系统人胚肾293细胞中发生相互作用,以验证酵母双杂交的结果。方法采用PCR方法及双酶切的方法构建含突变SOD1cDNA片段的真核表达质粒pC... 详细信息

目的用酵母双杂交方法显示突变的SOD1cDNA与人MAP/MARK1的片段结合,进一步探讨二者能否在哺乳动物表达系统人胚肾293细胞中发生相互作用,以验证酵母双杂交的结果。方法采用PCR方法及双酶切的方法构建含突变SOD1cDNA片段的真核表达质粒pCMV-Myc和含人MAP/MARK1的片段真核表达质粒pCMV-HA,分别或共同转染人胚肾293细胞,进行免疫共沉淀检测。结果免疫共沉淀结果表明,重组含突变的SOD1cDNA质粒pCMV-Myc分别与空载体pCMV-Myc、pCMV-HA共转染,免疫沉淀物中均未检测到结合蛋白,只有重组含突变SOD1cDNA真核表达质粒pCMV-Myc与重组含人MAP/MARK1的片段真核表达质粒pCMV-HA共转染时,在免疫沉淀物中能检测到结合蛋白,表现在蛋白免疫印迹上有特异性目的条带。结论突变的SOD1cDNA与人MAP/MARK1片段在人胚肾293细胞中存在蛋白水平的相互作用。

关键词：突变SOD1 cDNA 人MAP/MARK1 免疫共沉淀相互作用

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多功能医学实验平台的研制及在体外细胞温度效应观察中的初步应用

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第三军医大学学报 2007年第13期29卷 1289-1292页

作者：王贵波王晓芹罗高兴贺伟峰陈希炜吴军卞修武第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室第三军医大学西南医院重庆市疾病蛋白质组学重点实验室重庆400038 第三军医大学基础医学部药理学教研室重庆400038 第三军医大学西南医院病理学研究所

目的研制一种多功能医学实验平台。方法选用氧气、二氧化碳、湿度、温度传感器、控制器及效应器构建多功能医学实验平台并用于293细胞、PK15细胞受温度效应影响的试验。结果该多功能医学实验平台可对温度、湿度、氧气浓度和二氧化碳浓... 详细信息

目的研制一种多功能医学实验平台。方法选用氧气、二氧化碳、湿度、温度传感器、控制器及效应器构建多功能医学实验平台并用于293细胞、PK15细胞受温度效应影响的试验。结果该多功能医学实验平台可对温度、湿度、氧气浓度和二氧化碳浓度进行调节和控制,温度调控范围-20～+60℃,二氧化碳浓度调控范围0%～20%,氧气浓度调控范围0%～100%;湿度调控范围室温湿度至98%。采用该实验平台观察不同温度对293细胞、PK15细胞影响时发现,在10℃和20℃时,细胞出现胞体皱缩、突起变长等特征,细胞停止增殖。结论该多功能医学实验平台可调节温度、湿度、氧气浓度和二氧化碳浓度,可用于细胞低温保存等移植相关实验。

关键词：移植多功能医学实验平台细胞低温保存

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hTERT基因转染显著延长人骨髓间充质干细胞增殖能力的实验研究

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第三军医大学学报 2007年第16期29卷 1562-1565页

作者：石东文代飞池君陈希炜贺伟峰胡晓红罗高兴吴军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038 第三军医大学西南医院骨科全军矫形外科中心重庆400038 成都军区昆明总医院耳鼻咽喉科昆明650032

目的构建含有端粒酶逆转录酶(human telom erase reverse transcriptase,hTERT)基因的逆转录病毒,感染人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),观察外源性hTERT基因在hMSCs中的表达及其对hMSCs端粒酶活性和细胞增殖能力的影响。方法构建pLXSN-hTERT质粒,BamHⅠ酶切和测序鉴定,转染PT67包装细胞,G418抗性筛选获得产病毒阳性细胞克隆。用产病毒细胞珠和hMSCs共培养的方法转染hMSCs,G418抗性筛选。以未转染hM-SCs作为对照,用TRAPEZE方法检测hTERT基因转染hMSCs的端粒酶活性,用流式细胞仪检测细胞周期,并观察转染hMSCs的生长情况。结果成功构建了hTERT基因重组pLXSN-hTERT质粒,建立了产病毒pLXSN-hTER-PT67细胞株。获得了hTERT-hMSCs细胞群,与未转染的hMSCs相比,hTERT-hMSCs细胞群端粒酶活性明显增强,hTERT蛋白阳性表达细胞百分率提高,细胞的生命周期显著延长,细胞传代至46代,形态无明显改变,生长良好。结论逆转录病毒载体介导的hTERT基因转染可增强hMSCs的端粒酶活性,提高hMSCs的增殖能力。

关键词： hTERT 逆转录病毒端粒酶人骨髓间充质干细胞

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体外抗原诱导T细胞对NK细胞功能的抑制作用及其影响因素

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免疫学杂志 2007年第6期23卷 614-618页

作者：袁军王庆红王小娟解志杰郑峻松王锡华罗高兴吴军第三军医大学创伤烧伤复合伤国家重点实验室重庆西南医院烧伤研究所重庆市疾病蛋白质组学重点实验室重庆市器官移植基础研究所重庆400038 贵州省人民医院检验科贵阳550002

目的研究①体外抗原诱导后,T细胞对NK细胞功能的抑制及其机制。②APC及不同T细胞亚群对这一过程的影响。方法①分离小鼠APC及T细胞,按1∶3混合后分组进行诱导,48h加入NK细胞通过51Cr标准4h释放实验观察NK细胞功能状况;激光共聚焦显微镜... 详细信息

目的研究①体外抗原诱导后,T细胞对NK细胞功能的抑制及其机制。②APC及不同T细胞亚群对这一过程的影响。方法①分离小鼠APC及T细胞,按1∶3混合后分组进行诱导,48h加入NK细胞通过51Cr标准4h释放实验观察NK细胞功能状况;激光共聚焦显微镜观察T细胞对NK细胞功能的抑制作用;RT-PCR法检测抗原诱导后小鼠T细胞bc1、bc2的表达。②标准51Cr释放试验检测NK细胞功能以观察CD4+CD25+T细胞,抗原诱导的CD4+及CD4-T细胞对NK的抑制以及APC对体系中T-NK细胞间相互作用的影响。结果①51Cr释放率分别为:Anti-CD80诱导组21%,抗原激活组24.4%,细胞对照组34%,无T细胞对照组32%,前3组上清液与NK细胞作用后靶细胞51Cr释放率分别为34%、31.6%、33.1%。1、2两组51Cr释放率显著低于其余各组(P<0.01),两组间无显著性差异。无T细胞对照组及各组上清液中51Cr释放率无显著性差异。共聚焦显微镜下可观察到T细胞与NK细胞的直接接触。经抗原诱导48h的细胞培养物可检出bc1、bc2的表达。②祛除或未祛除APC两组51Cr的释放率均显著低于各对照组,且两组间无显著性差异(P>0.05)。CD4+CD25+T细胞组与CD4+T细胞组,51Cr释放显著低于其他各组(P<0.01),且前者显著低于后者(P<0.05);CD4-T组与两对照组间无显著性差异。结论①抗原诱导T细胞对NK细胞的抑制作用可通过直接接触的方式,与共刺激因子CD80无关。T细胞上bc1、bc2表达是T细胞抑制NK细胞的可能分子机制之一;②抗原诱导的APC单独或通过T细胞均不能抑制NK细胞功能,提示T细胞对NK细胞的抑制是APC非依赖性的。抗原诱导后CD4+T细胞群体对NK细胞功能有显著抑制,而CD4-群体则无此特性。CD4+CD25+T细胞在无抗原参与情况下对NK细胞有显著性抑制作用。

关键词： T细胞 NK细胞抗原共刺激阻断非经典MHC—I类抗原

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CD4^+CD25^+T细胞对NK细胞活性的影响

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重庆医学 2007年第11期36卷 1055-1057页

作者：王庆红王晓娟甘成军彭旭罗高兴吴军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆市疾病蛋白质组学重点实验室

目的初步探讨CD4+CD25+T细胞对NK细胞杀伤活性的影响,以及TGF-β1分子在其中的作用。方法磁珠分选纯化BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞与NK细胞,体外用ConA激活CD4+CD25+T细胞,将激活的CD4+CD25+T细胞与NK细胞共培养,并加入抗TGF-β1抗体... 详细信息

目的初步探讨CD4+CD25+T细胞对NK细胞杀伤活性的影响,以及TGF-β1分子在其中的作用。方法磁珠分选纯化BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞与NK细胞,体外用ConA激活CD4+CD25+T细胞,将激活的CD4+CD25+T细胞与NK细胞共培养,并加入抗TGF-β1抗体,在共培养的24h和48h,用51Cr标记的YAC-1检测NK细胞的杀伤毒性。结果初始CD4+CD25+T细胞在与NK细胞共培养的24h和48h能够显著抑制NK细胞活性,其抑制率分别为50.8%和49.1%,加入抗TGF-β1抗体后,抑制率变为:-0.1%、0.25%;ConA激活的CD4+CD25+T细胞在与NK细胞共培养的24h和48h也能显著抑制NK细胞活性,其抑制率分别为19%和20.9%,加入抗TGF-β1抗体后,抑制率变为25.2%、16.3%。结论TGF-β1参与了CD4+CD25+T细胞对NK细胞毒性的抑制,并且,其在CD4+CD25+T细胞激活、不激活状态下的影响结果不同。

关键词： CD4^+CD25^+T细胞 NK细胞抗-TGF-β1抗体细胞毒性

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利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用

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第三军医大学学报 2006年第24期28卷 2400-2402页

作者：袁顺宗彭旭马兵王庆红易绍萱贺伟峰陈希炜胡晓红张小容周丽娜罗高兴吴军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室第三军医大学西南医院疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038

目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypotheticalprotein,HT036)和P311间的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋... 详细信息

目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypotheticalprotein,HT036)和P311间的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用。结果构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Westernblot检测,可以检测到HA-HT036的表达。结论成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用。

关键词： HT036 P311 载体构建免疫共沉淀相互作用

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γδ T细胞与CD4^+ T细胞产生IFN-γ动力学的比较研究

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重庆医学 2006年第22期35卷 2042-2044页

作者：贺伟锋谭江玲罗高兴陈希炜尹芝南吴军第三军医大学西南医院烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室第三军医大学西南医院疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室 Yale University School of Medicine

目的通过比较分析γδ T细胞和CD4^+ T细胞IFN-γ合成动力学,以深入了解γδ T细胞产生IFN-γ特点。方法应用流式细胞技术分离技术分选出初始γβT细胞和初始CD4+T细胞。在此基础之上,通过定量RT-PCR技术检测γβT细胞和CD4+T细胞在不... 详细信息

目的通过比较分析γδ T细胞和CD4^+ T细胞IFN-γ合成动力学,以深入了解γδ T细胞产生IFN-γ特点。方法应用流式细胞技术分离技术分选出初始γβT细胞和初始CD4+T细胞。在此基础之上,通过定量RT-PCR技术检测γβT细胞和CD4+T细胞在不同刺激条件下IFN-γ基因转录情况。结果对比CD4+T细胞,γδT细胞产生IFN-γ不但需要更少的刺激信号以及更低的刺激域值,并且能更快地达到峰值。结论γβT细胞有加速产生IFN-γ的动力学特点。

关键词： γδT细胞 CD4^+T细胞 IFN-γ 动力学

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