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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第11期26卷 1013-1016页

作者：钱景彭慧琴周倩王巧玲陈浩浩严杰浙江大学医学院病原生物学教研室杭州310058 浙江大学医学院基础医学系2002级杭州310058

目的研究FasL相关蛋白SH3P12对FasL表达的影响。方法构建SH3P12真核细胞表达载体,并与FasL共同短暂表达于人胚肾细胞293T细胞。以免疫共沉淀和免疫印迹法确定目的蛋白之间的相互作用,以免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察SH3P12与Fas... 详细信息

目的研究FasL相关蛋白SH3P12对FasL表达的影响。方法构建SH3P12真核细胞表达载体,并与FasL共同短暂表达于人胚肾细胞293T细胞。以免疫共沉淀和免疫印迹法确定目的蛋白之间的相互作用,以免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察SH3P12与FasL在细胞内表达。结果在转染的293T细胞中,SH3P12与FasL可形成免疫共沉淀的蛋白-蛋白复合物。荧光蛋白标记结合显微镜观察提示在无SH3P12存在时,FasL主要分布于293T细胞膜,并伴随部分蛋白表达在细胞内高尔基体或内含体样颗粒中；在有SH3P12存在时,FasL与SH3P12形成复合体,共同定位于细胞膜,此时细胞内表达FasL量明显降低。结论SH3P12为FasL细胞内结合蛋白,其生物学活性可能为稳定FasL在细胞膜上的表达。

关键词： Fas配体 FasL相关蛋白蛋白质转运蛋白-蛋白相互作用

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ING4的原核表达及多克隆抗体的制备

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苏州大学学报（医学版） 2006年第6期26卷 930-932,935页

作者：王金志缪竞诚盛伟华谢宇锋杨吉成苏州大学医学院基础医学系细胞与分子生物学教研室江苏苏州215123

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白,制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a(+)-ING4,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a(+)-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750 bp左右的条带,测序结... 详细信息

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白,制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a(+)-ING4,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a(+)-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750 bp左右的条带,测序结果正确,用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带,表达的目的蛋白占菌体总蛋白10%以上,以包涵体形式存在,纯化后其纯度可达70%以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。

关键词：原核表达抗体 ING4

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日本血吸虫病免疫诊断研究进展

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中国血吸虫病防治杂志 2006年第4期18卷 318-320页

作者：陆正贤夏超明苏州大学医学院基础医学系病原生物学教研室苏州215006

血吸虫病免疫诊断技术经过不断改进和发展,具有较高的敏感性、特异性及可行性。检测循环抗体(CAb)成本低、操作简单、受宿主免疫状态影响小、可行性强,但治疗后抗体可多年维持较高水平,疗效考核价值不高。因此,目前的研究方向主要是寻... 详细信息

血吸虫病免疫诊断技术经过不断改进和发展,具有较高的敏感性、特异性及可行性。检测循环抗体(CAb)成本低、操作简单、受宿主免疫状态影响小、可行性强,但治疗后抗体可多年维持较高水平,疗效考核价值不高。因此,目前的研究方向主要是寻找治疗后消失较快的抗体,即短程抗体,以提高检测CAb的疗效考核价值。宿主体液中的循环抗原(CAg)则仅与活虫有关,感染一旦终止,宿主体液中的CAg也很快消失,因此检测CAg无论在诊断上,还是在考核疗效方面都具有重要意义。自1950年代起,国内外学者就开始进行了免疫诊断的研究,经过50多年的努力取得了显著的进展。现将近年来国内外血吸虫病免疫诊断的主要研究进展综述如下。[第一段]

关键词：免疫诊断技术日本血吸虫病诊断研究疗效考核价值循环抗体免疫状态短程抗体循环抗原进展综述治疗后

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O-糖基化位点预测及糖基化酶催化特点

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生命的化学 2006年第1期26卷 25-27页

作者：刘可人金美芳吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州215123

O-糖链维持所连接蛋白质部分的空间构象。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,其起始步骤具有复杂的高度选择性,迄今为止还未发现固定的模式。人们通过比较已知O-糖基化部位周围的氨基酸序列,推测出O-糖基化位点的一些规律及其酶的催... 详细信息

O-糖链维持所连接蛋白质部分的空间构象。O-糖基化作为生物体内重要的生物过程,其起始步骤具有复杂的高度选择性,迄今为止还未发现固定的模式。人们通过比较已知O-糖基化部位周围的氨基酸序列,推测出O-糖基化位点的一些规律及其酶的催化特性。

关键词： O-糖基化黏蛋白脯氨酸串联重复 ppGaNTases

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李斯特菌侵染宿主细胞过程中磷脂酶D活性变化的初步研究

李斯特菌侵染宿主细胞过程中磷脂酶D活性变化的初步研究

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中华预防医学会第二届学术年会暨全球华人公共卫生协会第二届年会

作者：纪蕾韩黎吴旭琴徐培君苏州大学基础医学院病原生物学教研室中国人民解放军疾病预防控制所医院感染监督中心苏州大学基础医学院病原生物学教研室苏州大学基础医学院病原生物学教研室

探讨单核增生李斯特菌刺激下的非洲绿猴肾细胞(Vero)内磷脂酶D(PLD)的活性变化。用放射性[3H]油酸标记Vero细胞内磷脂类化合物,设空白对照组,李斯特菌刺激组,佛波醇PMA刺激组,对三组Vero 细胞内的PLD活性进行测定比较;利用高效表达PLD2... 详细信息

探讨单核增生李斯特菌刺激下的非洲绿猴肾细胞(Vero)内磷脂酶D(PLD)的活性变化。用放射性[3H]油酸标记Vero细胞内磷脂类化合物,设空白对照组,李斯特菌刺激组,佛波醇PMA刺激组,对三组Vero 细胞内的PLD活性进行测定比较;利用高效表达PLD2功能缺陷蛋白的重组腺病毒感染Vero细胞,同样设立空白对照组,李斯特菌刺激组,佛波醇PMA刺激组,研究Vero细胞内PLD活性变化。PLD活性表示为其催化产生的特异性产物磷脂酰乙醇占放射性标记的磷脂类化合物总量的百分比。结果发现,在李斯特菌刺激感染正常Vero细胞过程中,胞内PLD活性升高约一倍(与空白对照组相比),而佛波醇PMA刺激诱导的正常Vero 细胞PLD活性变化增强更为显著。另外,PLD2型蛋白的功能缺陷蛋白mPLD2-K758R蛋白的过度表达对 Vero细胞的PLD基础活性无影响,但对李斯特菌和PMA诱导的PLD激活有明显抑制作用。这初步表明,在李斯特菌刺激Vero细胞或者Vero细胞对李斯特菌的吞噬过程中的确伴有PLD活性的变化,但此吞噬过程中 PLD激活的调控机制以及被激活的PLD的功能作用尚有待进一步探索。

关键词：李斯特菌磷脂酶D 感染

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人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2):RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2):RNA干扰载体的构...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：朱燕仇灏刘可人吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室

目的:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O-聚糖合成的第一步反应,将 UDP-GalNAc中的GalNAc基转移至蛋白多肽链上特定序列中的Set或Thr,从而合成GalNAcα-O- Ser／Thr,初步研究提示该酶可能与肿瘤的生长和转移有关。ppGalN... 详细信息

目的:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O-聚糖合成的第一步反应,将 UDP-GalNAc中的GalNAc基转移至蛋白多肽链上特定序列中的Set或Thr,从而合成GalNAcα-O- Ser／Thr,初步研究提示该酶可能与肿瘤的生长和转移有关。ppGalNAc-T2是该家族中组织分布及底物谱较广的成员,作为O-糖链合成的起始酶,很有可能是O-糖链合成的限速酶,有着重要的生物学意义。本文旨在探讨ppGalNAc-T2在肿瘤浸润转移及增殖中的作用。方法:RNA干扰技术是2001年首次应用于哺乳动物细胞的新的分子生物学技术,是研究转录后调控的有效工具,可用于功能基因组研究以及基因治疗等临床应用。遵循RNA干扰目标序列的选取原则,利用互联网资源,对ppGalNAc-T2基因 mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),并且由PCR方法扩增得到带有RNA pol Ⅱ启动子的siRNA内源表达系统,脂质体介导转染至人胃癌细胞株SOC7901,运用RT-PCR方法检测转染后各细胞株ppGalNAc-T2 mRNA水平的表达变化,筛选出对ppGalNAc-T2 mRNA水平表达抑制效率最高的siRNA;化学合成带荧光标记的该段RNA Oligo,转染细胞并用荧光显微镜观察转染情况,RTPCR 方法检测转染后细胞ppGalNAc-T2的表达,进一步鉴定该siRNA对ppGalNAc-T2的抑制作用;将这段siRNA插入到RNA干扰真核表达载体pSilenCircle中,脂质体介导转染人胃癌细胞株 SGC7901,经G418筛选后,利用RT-PCR和Western blot方法检测MMP2、MMP14、TGF-β1等肿瘤浸润转移相关基因的表达变化,通过MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:筛选得到能高效引起ppGalNAc -T2基因表达沉默的siRNA,成功构建了ppGalNAc-T2的RNA干扰真核表达载体并转染入细胞,得到稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株。转染了重组载体后的细胞,随着ppGalNAc-T2表达的下调,MMP2、MMP14、TGF-β1等基因在mRNA和蛋白质水平的表达不同程度地增高了,细胞增殖水平则较原细胞株有所降低。结论:稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株为今后进一步深入研究PPGalNAc -T2的生物学功能开辟了新道路。同时由于TGF-β1、MMP2、MMP14都是与肿瘤的浸润转移、增殖相关的指标,因此推测ppGalNAc-T2与肿瘤的浸润转移、增殖密切相关。

关键词： RNA 肿瘤浸润转移半乳糖转移酶 ppGalNAc-T2 乙酰氨基干扰载体初步研究

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人类多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2抗原表位分析、抗体制备及亚细胞定位

人类多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2抗原表位分析、抗体制备及亚细...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：杭赛宇胡鹤娟朱燕马震宇闫石吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所

为了研究人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)蛋白表达的亚细胞结构定位,制备特异性抗体。我们联合应用了多种方法对多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的二级结构和表面特性进行了细致地分析,发现其优势抗原表位均位于蓖麻样结... 详细信息

为了研究人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)蛋白表达的亚细胞结构定位,制备特异性抗体。我们联合应用了多种方法对多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的二级结构和表面特性进行了细致地分析,发现其优势抗原表位均位于蓖麻样结构域中;进一步采用了RT-PCR方法克隆到蓖麻样结构域cDNA片段,将获得的蓖麻样结构域cDNA片段定向插入到表达载体PGEX-5X-3中,且导入大肠杆菌,诱导表达,获重组融合蛋白;将得到的重组融合蛋白免疫新西兰大白兔,我们获得了兔抗人ppGalNAc-T2的多克隆抗体,并进行ELISA法检测抗体效价,抗体滴度为1:3200,并进行了有效性检测;蛋白质印迹实验证实此多克隆抗体具有较好的反应性和特异性。通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位,发现ppGalNAc-T2主要表达在细胞核旁的Golgi复合体,说明它们主要分布在Golgi复合体上,证实它们是在Golgi复合体参与蛋白质的糖链修饰。本文特异性扩增和表达蓖麻样结构域并制备了抗体,有利于进一步阐明RICIN结构域的功能,为研究多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2及其家族的结构和功能打下基础。

关键词：多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T) 抗原表位抗体亚细胞定位

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人类β3-半乳糖基转移酶基因β3GALT7的克隆、表达及功能的初步研究

人类β3-半乳糖基转移酶基因β3GALT7的克隆、表达及功能的初步研...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：吴艳孙其昌周嘉良吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室苏州大学生化工程研究所

β3GALT7(AY277592,EC2．4．1-)基因是我们实验室利用TBLASTN信息途径,以β3GALT1为信息探针进行同源帅选后从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3-半乳糖基转移酶家族的一个新成员。 Northern杂交显示其在肺、喉和回肠组织中高表达而在舌、... 详细信息

β3GALT7(AY277592,EC2．4．1-)基因是我们实验室利用TBLASTN信息途径,以β3GALT1为信息探针进行同源帅选后从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3-半乳糖基转移酶家族的一个新成员。 Northern杂交显示其在肺、喉和回肠组织中高表达而在舌、乳房、子宫等组织中表达较低。为了进一步认知该酶的功能,我们进行了一些探索性的研究。方法:通过原核表达系统表达β3GALT7蛋白,以纯化的β3GALT7蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并用Western Blot和免疫组化的方法分析其在多种组织和细胞中的表达情况;通过荧光免疫细胞化学的方法进行亚克隆定位;克隆β3GALT7编码区的基因并构建其真核正义和反义表达载体,并运用脂质体介导将此重组载体转染中度表达该基因的人 SGC7901细胞株,和较高表达β3GALT7的A549细胞株,并通过荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,RTPCR, western印迹等方法对其进行了初步的功能研究。结果:获得了较纯的β3GALT7表达蛋白和高效价、高特异性的抗β3GALT7的多克隆抗体,免疫组化显示肿瘤细胞和组织中该酶有较高的表达,与正常组织比较具有一定的差异,亚克隆定位显示β3GALT7大部分位于核膜周围的胞浆。同时获得了β3GALT7的正义、反义的真核重组质粒及稳定转染了这些重组质粒的细胞株,发现转染了正义质粒的 SGC7901细胞其β3GALT7蛋白表达水平增加,MMP2、MMP14的蛋白表达水平随其亦有所上升,而转染了反义β3GALT7的A549细胞其MMP2和MMP14的蛋白表达量随着β3GALT7的被抑制而成正相关下降,提示β3GALT7可能与肿瘤的发生、发展和转移具有一定的相关性。

关键词：半乳糖基转移酶 β3GALT7 多克隆抗体免疫组化原核表达真核表达

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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在不同发育阶段的小鼠脑中的mRNA表达差异

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在不同发育阶段的小鼠脑中的mRN...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会

作者：胡鹤娟杨静杭赛宇吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室生化工程研究所

目的:为了观察三个不同发育阶段的小鼠脑中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(polypeptide: N-acetylgalactosaminytransferase,ppGalNAc-T)的表达差异,以探讨多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在脑发育中的功能与作用;方法:取不同发育阶... 详细信息

目的:为了观察三个不同发育阶段的小鼠脑中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(polypeptide: N-acetylgalactosaminytransferase,ppGalNAc-T)的表达差异,以探讨多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在脑发育中的功能与作用;方法:取不同发育阶段(即孕末期,新生期,4周龄)的小鼠各六只, 取脑组织后,我们采用半定量逆转录PCR方法从mRNA水平上粗略地研究了多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在三个发育阶段的表达情况,以β-actin作为内对照,计算酶家族各成员的相对表达量,从而进行半定量分析;结果:我们发现三个不同发育阶段的小鼠脑中此酶家族的表达谱是不尽相同的。 T1、T2、T3、T4、T9、T10、T13、T14稳定表达,T3、T4、T9、T10在胎鼠中表达较高,在新生鼠和4周龄鼠中表达较低,且在新生鼠和4周龄鼠中的表达基本相同,T1、T2、T14等在各发育阶段鼠脑中表达基本无变化;结论:我们初步认为在小鼠脑的发育过程中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族的表达有一定的变化,在今后的实验中,将在时间点及脑分区,即时空性表达方面,作更进一步地完善细致的研究, 进一步推动多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在神经系统发育方面的研究工作,以探讨多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在脑发育中的功能与作用

关键词： ppGalNAc-T 小鼠脑表达 RT-PCR

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人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族分子进化的初步研究

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江苏大学学报（医学版） 2006年第2期16卷 105-108页

作者：杭赛宇吴士良苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室江苏苏州215123 苏州大学生化工程研究所江苏苏州215123

目的:探讨人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性,揭示其进化规律。方法:采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较,结构域分析和进化树绘制。结果:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二... 详细信息

目的:探讨人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性,揭示其进化规律。方法:采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较,结构域分析和进化树绘制。结果:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二级结构均有较高的同源性,系统进化树显示各成员来源于同一祖先并在不同时期分野。结论:各成员来自于同一祖先的同一家族,其进化方式属于趋异性进化。

关键词：多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶序列比较结构域系统进化树

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