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miR-206抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞Cdc42蛋白表达及其对细胞骨架的影响

第三军医大学学报 2010年第6期32卷 568-571页

作者：刘浩曹友德叶维霞孙阳阳重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探讨miR-206对MDA-MB-231乳腺癌细胞Cdc42表达的调控及对细胞骨架的影响。方法采用Li-pofectamineTM2000转染miR-206进入MDA-MB-231细胞,48h后Western blot检测转染后乳腺癌细胞Cdc42、MMP-2和MMP-9蛋白质表达。用免疫荧光显微镜观察细胞丝状伪足的改变,进一步用侵袭迁移实验检测转染前后细胞侵袭力和迁移力的变化。结果Western blot检测Cdc42、MMP-2和MMP-9在转染前后的表达结果,其条带灰度值与阴性对照组相比明显下降(P<0.05);细胞免疫荧光计数每个细胞平均丝状伪足数,空白对照组为(14.99±5.53),表皮生长因子(EGF)组为(23.59±3.92),miR-206转染组为(9.45±3.59),miR-206+EGF组为(11.77±2.85)。与空白对照组和EGF组比较,miR-206转染组或miR-206+EGF组细胞丝状伪足明显减少(P<0.05)。侵袭实验结果显示,小室膜下的细胞数量空白对照组为(311.7±23.5),miR-206转染组为(65.0±13.9),二者差异有统计学意义(P<0.01)。迁移实验结果显示,小室膜下的细胞数量空白对照组为(793.0±76.3),而miR-206转染组为(415.3±20.0),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论miR-206能抑制MDA-MB-231细胞Cdc42的表达和细胞丝状伪足的形成,并且能抑制细胞的侵袭迁移能力。

关键词：乳腺肿瘤侵袭转移 miR-206 Cdc42

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34例肝糖原累积病的临床病理观察

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重庆医科大学学报 2010年第4期35卷 605-607页

作者：刘琳管小琴王立娟赵瑞秋许红梅廖晓岗重庆医科大学基础医学院病理教研室重庆400016 重庆医科大学附属儿童医院感染消化科重庆400014 重庆医科大学基础医学院电镜室重庆400016

目的:分析肝糖原累积病的临床病理表现,以提高对该病的认识。方法:34例确诊为肝糖原累积病患儿的临床资料,用光镜及电镜观察其肝活检组织的病理形态。结果:肝糖原累积病患儿临床主要表现为肝大,生长发育滞后,部分有低血糖表现;实验室检... 详细信息

目的:分析肝糖原累积病的临床病理表现,以提高对该病的认识。方法:34例确诊为肝糖原累积病患儿的临床资料,用光镜及电镜观察其肝活检组织的病理形态。结果:肝糖原累积病患儿临床主要表现为肝大,生长发育滞后,部分有低血糖表现;实验室检查可见低血糖,高乳酸血症,肝功能异常;肝穿刺活检光镜观察见肝细胞肿胀,呈植物细胞样镶嵌状排列;胞质内有大量红色粉尘样物,过碘酸希夫染色(Periodicacid-schiff,PAS)阳性证实其为糖原;电镜示肝细胞胞质内大量糖原沉积及大小不等脂滴形成。结论:肝糖原累积病发病隐匿,对临床不明原因的生长发育迟缓、肝脏肿大、有低血糖及酸中毒表现的患儿应疑诊本病。肝穿刺活检PAS染色及电镜观察对本病的确诊有重要意义。

关键词：糖原累积病肝脏婴幼儿

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胃癌细胞高尔基体的蛋白质组学技术平台的建立

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中国生物工程杂志 2010年第2期30卷 27-31页

作者：何婷婷易永芬李艳青肖钟重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

采用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳(2-DE)分离高尔基体蛋白质,用ImageMaster 2D软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立胃癌细胞... 详细信息

采用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳(2-DE)分离高尔基体蛋白质,用ImageMaster 2D软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。结果显示分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,运用质谱技术鉴定出12个蛋白质,包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白、细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化,双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析,首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线,为胃癌细胞内高尔基体功能的深入研究奠定了基础。

关键词：胃癌细胞高尔基体亚细胞器蛋白质组学亚细胞器分离

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^(99m)Tc-EGFR-McAb用于荷人肺腺癌裸鼠的放射免疫显像研究

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重庆医科大学学报 2010年第5期35卷 695-699页

作者：段东朱玉泉李少林重庆医科大学附属第一医院核医学科重庆医科大学基础医学院核医学教研室重庆400016

目的:评价99mTc标记的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体(Monoclone antibody,McAb)用于荷人肺腺癌裸鼠的放射免疫显像(Radioimmunoimaging,RII)效果,并进行相关比较分析。方法:①建立荷人肺腺癌裸鼠动物模型;②采用99mTc直接标记法标记抗EGFR的单克隆抗体,并对标记抗体的特性进行鉴定;③利用99mTc-EGFR-McAb进行荷人肺腺癌裸鼠模型的RII及体内分布研究。结果:99mTc对EGFR-McAb的标记率为91.5%±3.8%,标记抗体比活度为(2.8±0.2)MBq/μg,放射化学纯度为96.5%±3.2%。放射免疫显像结果显示,99mTc-EGFR-McAb对肿瘤组织有较高的亲和性,通过感兴趣区(Regional interest,ROI)技术测得T/NT比值为2.74±0.5,明显高于对照组(P<0.05)。标记抗体的体内分布结果与显像结果基本一致。结论:99mTc-EGFR-McAb用于荷人肺腺癌裸鼠的放射免疫显像能得到较理想的靶/非靶比值,EGFR是肺腺癌放射免疫显像研究值得推荐的目标抗原。

关键词：表皮生长因子受体放射免疫显像单克隆抗体肺肿瘤

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小鼠微RNA miR-21真核表达质粒的构建及其在小鼠肾小球系膜细胞中的表达

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中国生物制品学杂志 2010年第7期23卷 708-710页

作者：张政彭惠民徐晓明何晓燕重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学及肿瘤研究中心重庆400016

目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,... 详细信息

目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR技术检测miR-21的表达。结果经酶切鉴定和测序证实,合成的miR-21基因序列完全正确,并已成功克隆到真核表达质粒pGenesil-1上。重组真核表达质粒转染小鼠肾小球系膜细胞后,筛选出的阳性克隆可稳定高表达miR-21。结论已成功构建miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中高效表达,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了基础。

关键词：微RNA miR-21 真核细胞基因表达肾小球系膜细胞

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包皮成纤维细胞作为饲养层对人胚胎生殖细胞生长的影响

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解剖学报 2010年第6期41卷 876-879页

作者：黎晓莉王璐吴宏张雁关雪晶姜蓉重庆医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的以人包皮成纤维细胞为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞,观察饲养层对其生长的影响,并对人胚胎生殖细胞进行鉴定。方法分离培养4～5岁小儿包皮成纤维细胞,取P3～P30代细胞用丝裂霉素灭活后铺板备用,酶联免疫吸附测定(ELISA)-双抗夹心... 详细信息

目的以人包皮成纤维细胞为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞,观察饲养层对其生长的影响,并对人胚胎生殖细胞进行鉴定。方法分离培养4～5岁小儿包皮成纤维细胞,取P3～P30代细胞用丝裂霉素灭活后铺板备用,酶联免疫吸附测定(ELISA)-双抗夹心法检测其分泌物成纤维细胞生长因子(FGF)的含量;分离培养5～11周人胚胎原始生殖细胞,在不添加任何细胞因子的人包皮成纤维细胞饲养层上培养人胚胎生殖细胞;细胞化学法检测人胚胎生殖细胞碱性磷酸酶的活性,免疫细胞化学法检测其胚胎表面特异性抗原SSEA-1及SSEA-4的表达,RT-PCR法检测Oct-4的表达。结果包皮成纤维细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;P3～P30代包皮成纤维细胞上清液中FGF含量在(172.09±2.66)pg/L～(245.25±1.66)pg/L之间波动。分离培养的人胚胎生殖细胞在饲养层上可形成典型的胚胎生殖细胞集落,体外连续培养超过3代,其碱性磷酸酶活性呈强阳性,集落未分化标志检测显示SSEA-l、SSEA-4呈阳性,Oct-4表达阳性。结论用人包皮成纤维细胞作为饲养层能支持人胚胎生殖细胞的生长并维持未分化状态。

关键词：包皮成纤维细胞胚胎生殖细胞饲养层酶联免疫吸附测定-双抗夹心法免疫组织化学反转录-聚合酶链式反应人

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人子宫颈癌PD-L1的表达及其与肿瘤内浸润T细胞的相关性研究

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第三军医大学学报 2010年第11期32卷 1173-1176页

作者：王渝琦徐光旭耿卫朴唐均英徐曼重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科重庆400016

目的观察负性免疫调节分子程序性死亡配体1(programmed death receptor-ligand1,PD-L1)在人子宫颈癌的表达及其与肿瘤内T淋巴细胞浸润的关系。方法免疫组织化学染色观察5例正常宫颈组织、7例高级别宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithel... 详细信息

目的观察负性免疫调节分子程序性死亡配体1(programmed death receptor-ligand1,PD-L1)在人子宫颈癌的表达及其与肿瘤内T淋巴细胞浸润的关系。方法免疫组织化学染色观察5例正常宫颈组织、7例高级别宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CINⅡ-Ⅲ)组织和67例子宫颈癌组织中PD-L1的表达和淋巴细胞PD-1的表达,免疫荧光染色观察相应组织内浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量,TUNEL法检测淋巴细胞凋亡。结果正常子宫颈上皮不表达PD-L1;宫颈瘤变上皮不表达或弱阳性表达PD-L1,70%(47/67)的宫颈癌表达PD-L1。肿瘤内浸润的部分淋巴细胞表达PD-1。子宫颈瘤变上皮与子宫颈鳞状细胞癌PD-L1表达存在明显差异(P<0.01),浅表浸润的子宫颈鳞状细胞癌PD-L1的表达略低于深部浸润的鳞状细胞癌,但无显著差异;PD-L1阳性病例肿瘤局部CD8+T细胞数量显著减少,且PD-L1表达与CD8+T细胞数量明显负相关(r=-0.82,P<0.01),但与肿瘤局部CD4+T细胞数量无明显相关性(r=-0.05,P>0.05);部分PD-L1阳性的子宫颈癌局部浸润的淋巴细胞存在凋亡现象。结论子宫颈癌细胞表达PD-L1,且PD-L1的表达与肿瘤局部浸润的CD8+T细胞数量减少有关,但与浸润的CD4+T细胞数量无关。癌细胞表达PD-L1可能促进了肿瘤内浸润的淋巴细胞凋亡。

关键词：子宫颈癌 PD-L1 CD4+Tcell CD8+Tcell 凋亡

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抑制Coronin-1基因表达的siRNA载体的构建和筛选

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第4期26卷 318-321页

作者：严莎陈全吕玉春侯艳王瑜伟重庆医科大学基础医学院免疫学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入... 详细信息

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察、实时定量PCR和Western blot法检测其对Coro-nin-1基因表达的影响。结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9%和75.1%。结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coro-nin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定基础。

关键词： Coronin-1 RNA干扰 siRNA质粒载体结核分支杆菌

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Survivin反义寡核苷酸联合TCS诱导食管癌细胞Eca-109凋亡的研究

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重庆医科大学学报 2010年第9期35卷 1339-1343页

作者：陈玉龙邓华瑜重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室重庆400016

目的:探讨survivin反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)联合TCS诱导细胞凋亡的作用及其分子机制。方法:以食管癌细胞Eca-109为实验对象,将实验分6组:未处理组、脂质体组、survivin正义寡核苷酸组(Sense oligodeoxyn ucleotide,SODN)、survivin反义寡核苷酸组(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)、天花粉蛋白组(Trichosan thein,TCS)、survivin反义寡核苷酸联合天花粉蛋白组。各处理因素作用食管癌细胞Eca-10948h,RT-PCR检测Eca-109细胞survivin mRNA表达变化;Western blot检测Survivin、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测Eca-109细胞早期凋亡率。结果:ASODN组、TCS组和联合组的survivin mRNA和Survivin蛋白表达水平明显降低,联合组较单独药物组(ASODN组、TCS组)降低,而以上3组的早期凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平明显升高,联合组较单独药物组增高(P<0.05);TCS组和联合组细胞的Bcl-2蛋白的表达水平明显降低,Bax蛋白的表达增加。结论:TCS联合survivin的ASODN在诱导Eca-109细胞的凋亡方面,能够发挥协同作用;TCS和survivin的ASODN共同抑制survivin基因表达,TCS下调Bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达,分别激活caspase级联反应上游、下游途径,是两药发挥协同作用的分子基础。

关键词：食管癌反义寡核苷酸凋亡

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低渗状态下星形胶质细胞AQP8的表达变化

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第三军医大学学报 2010年第11期32卷 1136-1140页

作者：杨美孙善全余维华刘辉卓飞邱国平重庆医科大学基础医学院人体解剖学教研室重庆400016 重庆医科大学神经科学研究中心重庆400016

目的探讨低渗透压作用下,星形胶质细胞水通道蛋白8(aquaporin8,AQP8)的表达变化规律。方法原代培养大鼠星形胶质细胞,随机分为对照组(常规培养液)和低渗组(268、254、240mmol/L),每组分别作用1、3、6、12、24h,共5个时间点。通过MTT比... 详细信息

目的探讨低渗透压作用下,星形胶质细胞水通道蛋白8(aquaporin8,AQP8)的表达变化规律。方法原代培养大鼠星形胶质细胞,随机分为对照组(常规培养液)和低渗组(268、254、240mmol/L),每组分别作用1、3、6、12、24h,共5个时间点。通过MTT比色法检测细胞活力,免疫细胞化学、免疫荧光、Realtime-PCR研究AQP8及其mRNA的表达变化。结果对照组星形胶质细胞的细胞形态、细胞活性、AQP8及其mRNA的表达在各时间点均无明显变化(P>0.05)。低渗组中,星形胶质细胞水肿,细胞活性下降;AQP8及其mRNA的表达水平随低渗程度的下调和低渗作用时间的延长而增强。低渗液(268、254、240mmol/L)作用后,免疫细胞化学显示星形胶质细胞的AQP8表达从低渗作用1h的(0.2583±0.0098,0.2800±0.0109,0.2817±0.0075)到低渗作用24h的(0.3850±0.0109,0.4067±0.0070,0.4250±0.0104)(P<0.05);RealtimePCR显示:AQP8与beta-actin的mRNA水平比从低渗作用1h的(0.1275±0.0118,0.1344±0.0324,0.1675±0.0078)上升到(3.2780±0.1212,5.4104±0.1041,8.3510±0.2880)。结论低渗作用下,AQP8介导的水分子运输可导致星形胶质细胞肿胀,继而引发细胞结构、功能的损伤;AQP8的表达上调可能是导致星形胶质细胞水肿形成和发展的重要分子机制之一。

关键词：水通道蛋白8 星形胶质细胞渗透压

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