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第九届全国肝脏疾病临床学术大会

作者：李虎胡鹏重庆重庆医科大学附属第二医院感染科感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学病毒性肝炎研究所 400010

目的研究在CHB患者中乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)预存耐药的情况.方法选取28例未经核苷(酸)类似物治疗的CHB患者的血清标本(包括免疫耐受期10例,免疫活动期9例,非活动期9例),检测HBV DNA,HBsAg,HBeAg,抗-HBs,抗-HBe,ALT等,... 详细信息

目的研究在CHB患者中乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)预存耐药的情况.方法选取28例未经核苷(酸)类似物治疗的CHB患者的血清标本(包括免疫耐受期10例,免疫活动期9例,非活动期9例),检测HBV DNA,HBsAg,HBeAg,抗-HBs,抗-HBe,ALT等,同时提取HBV DNA,Nest-PCR扩增RT区基因与T载体连接后转入JM109感受态细胞中培养.每例标本随机挑选25 ～ 30个克隆,菌液PCR验证后测序.运用BLAST,MAFFT,GenBank,HBVdb等进行序列分析.结果纳入研究的28例CHB患者的平均年龄为31岁,50％为男性,HBV DNA平均值为5.99 log10 IU/mL,ALT平均值为71 U/L,68％ (19/28)患者为HBeAg阳性,32％ (9/28)为HBeAg阴性,75％ (21/28)的患者为基因B型感染,25％ (7/28)的患者为基因C型感染.共获得601条HBV RT基因序列,平均每例标本21条.1.16％ (7/601)的序列及3.57％ (1/28)的患者检测出了耐药. 所有的耐药株集中在基因B型、免疫活动期和HBeAg阳性阶段,而在基因C型、免疫耐受期和非活动期以及HBeAg阴性阶段的HBV病毒株均为野生株(统计值分别为：1.304、 11.697、 1.176;P值分别为：0.253、0.001、 0.183).对检测出耐药的个体准种分析显示：耐药HBV病毒株的比例为31.82％ (7/22),其中42.86％ (3/7)耐药株表现为rt I169T+rt A181T,50.14％ (4/7)耐药株表现为rt A181T.结论在慢性乙型肝炎患者中预存耐药的发生率低且与免疫状态有关.

关键词：肝炎,乙型耐药突变准种

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甲型H7N9流感病毒血凝素和神经氨酸酶的进化及抗原位点变异分析

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中华医学杂志 2013年第30期93卷 2381-2384页

作者：李虎胡鹏重庆医科大学附属第二医院感染科感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学病毒性肝炎研究所 400010

目的分析甲型H7N9流感病毒的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）进化及其抗原位点变异。方法从美国国立生物技术信息中心（NCBI）和全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）数据库检索并下载从建库到2013年4月13日的I-17N9病毒HA、NA的基因... 详细信息

目的分析甲型H7N9流感病毒的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）进化及其抗原位点变异。方法从美国国立生物技术信息中心（NCBI）和全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）数据库检索并下载从建库到2013年4月13日的I-17N9病毒HA、NA的基因和氨基酸序列。应用Clustal．W、MEGA5．0、NetNGlyc1．0Server、DNAMAN等生物信息学软件，对HA、NA的基因序列和氨基酸序列进行比对分析以及预测其潜在的抗原位点。结果共有26条HA基因和氨基酸序列以及24条NA基因和氨基酸序列纳入分析。美洲地区的H7N9流感病毒HA、NA基因和氨基酸的保守性较亚欧地区高。HA、NA基因进化分为亚欧地区和美洲地区两大系。所有病毒HA裂解位点附近仅含1个碱性氨基酸R（Arg）。HA蛋白裂解位点和NA蛋白糖基化位点表现出地区差异，HA蛋白糖基化位点保守。HA、NA蛋白在亚欧地区和美洲地区有多个抗原位点发生变异。7例中国分离的新型H7N9病毒进化位于亚欧地区分支，NA的茎部在69～73位有5个氨基酸缺失，HA蛋白裂解位点、糖基化位点未发生变异，HA、NA蛋白多个抗原位点发生了与其他病毒株不同的变异。结论H7N9病毒HA、NA进化表现出地区差异性。NA茎部氨基酸的缺失和HA、NA蛋白多个抗原位点的变异可能与人感染H7N9流感爆发有关。

关键词：流感病毒A型 H7N9亚型血凝素类神经氨酸酶抗原位点进化分子

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人感染H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶的B细胞表位预测

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细胞与分子免疫学杂志 2013年第12期29卷 1319-1321,1326页

作者：李虎胡鹏重庆医科大学附属第二医院感染科感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆医科大学病毒性肝炎研究所重庆400010

目的利用计算机软件预测人感染H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的B细胞表位。方法以HA、NA的氨基酸序列为基础,用Protean、PORTER、MEGA等生物信息学软件综合预测HA、NA蛋白可能的B细胞表位,再结合吴玉章的平均抗原指数方案... 详细信息

目的利用计算机软件预测人感染H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的B细胞表位。方法以HA、NA的氨基酸序列为基础,用Protean、PORTER、MEGA等生物信息学软件综合预测HA、NA蛋白可能的B细胞表位,再结合吴玉章的平均抗原指数方案进一步筛选。结果 HA蛋白最有可能的B细胞表位位于其N端的第53～57、179～183区段,HA蛋白的其它区段:62～66、98～101、164～166、315～320、424～426、443～445、493～496等也有可能存在B细胞表位。NA蛋白最有可能的B细胞表位位于N端的第321～329、379～386区段,NA蛋白的其他区段:46～48、52～54、74～78、136～141、145～150、160～164、194～197、246～248、333～343、426～431等也有可能存在B细胞表位。结论综合多种方案预测了H7N9病毒HA、NA蛋白的B细胞表位,为人感染H7N9禽流感病毒表位疫苗研究提供了实验基础。

关键词： H7N9 HA NA B细胞表位

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NK与NKT细胞在慢加急性肝衰竭患者外周血中的变化分析

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重庆医学 2013年第31期42卷 3747-3749页

作者：彭辉常琳王磊陈敏重庆医科大学附属第二医院检验科 400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所/感染性疾病分子生物学省部共建教育部重点实验室 400016

目的研究NK及NKT细胞在乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者外周血中的变化。方法用流式细胞仪分别检测25例健康对照者(HC)、40例慢性乙型肝炎(CHB)患者、26例HBV-ACLF患者外周血淋巴细胞中NK、NKT细胞的比例,经统计分析,比较各组... 详细信息

目的研究NK及NKT细胞在乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者外周血中的变化。方法用流式细胞仪分别检测25例健康对照者(HC)、40例慢性乙型肝炎(CHB)患者、26例HBV-ACLF患者外周血淋巴细胞中NK、NKT细胞的比例,经统计分析,比较各组间NK或NKT的差异,同时分析HBV-ACLF组中的NK或NKT细胞与乙型肝炎标志物或肝功能间的相关性。结果 HC、CHB、HBV-ACLF组外周血的NK细胞比例分别为(15.0±6.0)%、(11.4±6.8)%和(8.9±6.7)%,HBV-ACLF组与其他两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而NKT细胞在HC、CHB、HBV-ACLF组外周血中的比例分别为(1.9±1.3)%、(4.3±3.7)%和(5.4±8.6)%,HBV-ACLF组与HC组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HBVACLF患者外周血内NK细胞比例显著性降低,而NKT细胞比例显著性升高,他们可能在HBV-ACLF疾病中发挥着一定的作用。

关键词：杀伤细胞,自然 NKT 慢加急性肝衰竭乙型肝炎病毒

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转化生长因子β1的小干扰RNA对肝纤维化大鼠Smad蛋白表达的影响

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中华肝脏病杂志 2012年第4期20卷 289-293页

作者：孙银春郎清钱克莉肖朗刘杞石小枫重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室 400010 四川省达州市中心医院感染科

目的研究转化生长因子（TGF）β1的小干扰RNA（siRNA）对CCl4诱导肝纤维化大鼠TGFβ1／Smad信号通路的影响。方法以前期研究的TGFβ siRNA治疗前后肝纤维化大鼠肝脏组织作为研究对象，分为正常组，模型组、TGFβ1 siRNA0．125mg／kg组、... 详细信息

目的研究转化生长因子（TGF）β1的小干扰RNA（siRNA）对CCl4诱导肝纤维化大鼠TGFβ1／Smad信号通路的影响。方法以前期研究的TGFβ siRNA治疗前后肝纤维化大鼠肝脏组织作为研究对象，分为正常组，模型组、TGFβ1 siRNA0．125mg／kg组、TGFβ1 siRNA0．25mg／kg组和阴性对照组（0．25mg／kg非特异性靶序列）。用免疫组织化学和Western blot检测Smad2、3、4、7的蛋白表达；Real-time PCR法检测Smad2、3、4、7的mRNA表达。多组间数据比较用方差分析，两两比较采用q检验。结果免疫组织化学结果显示TGF-β siRNA0．25mg／kg组及0．125mg／kg组Smad2／3、4的蛋白表达量较模型组、阴性对照组明显减少（F值分别为115．538，117．178，P〈0．01），TGFβ1 siRNA 25mg／kg组表达量较0．125mg／kg组少（P〈0．05）。TGFβ1 siNA0．25mg／kg组及0．125mg／kg组Smad7的蛋白表达量较模型组、阴性对照组增加（F=125．34，P〈0．01），TGFβ1 siRNA0．25mg／kg组表达量较0．125mg／kg组多（P〈0．05）。Western blot结果与之相似。Real-time PCR结果显示，与模型组和阴性对照组比较，TGFβ1 siRNA可以明显抑制Smad2、3、4基因的表达，且TGFβ1 siRNA0．25mg／kg组Smad2、3、4的mRNA表达量（相对表达量分别为2．870±0．705、2．904±0．414、2．667±0．466）较TGFβ1积NA0．125mg／kg组（相对表达量分别为5．998±0．329、5．827±0．781、5．102±0．102）明显减少（P〈0．05）。TGFβ1 siRNA0．25mg／kg组及0．125rng／kg组Smad7的mRNA表达量较模型组、阴性对照组增加（F=29．615，P〈0．01），TGFβ1 siRNA0．25mg／kg组表达量较0．125mg／kg组多（P〈0．05）。结论TGFβ1 siRNA干扰大鼠TGFβ1表达后，Smad2、3、4表达量明显降低，而Smad7表达仍维持在较高水平，这利于肝纤维化的改善。

关键词：肝硬化转化生长因子β Smad

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KRT8对HBV复制影响的体外研究

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西南大学学报（自然科学版） 2012年第4期34卷 65-70页

作者：钟卿梁文彭明利胡鹏重庆医科大学附属第二医院感染科重庆400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所重庆400010 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400010

目的:研究宿主蛋白KRT8对HBV复制的影响.方法:体外培养稳定表达HBV的肝癌细胞株(HepG2.2.15),分别用干扰KRT8基因的siRNA转染HepG2.2.15细胞和高表达KRT8基因的质粒转染HepG2.2.15细胞.RT-PCR验证转染效率,荧光定量PCR检测转染48小时后... 详细信息

目的:研究宿主蛋白KRT8对HBV复制的影响.方法:体外培养稳定表达HBV的肝癌细胞株(HepG2.2.15),分别用干扰KRT8基因的siRNA转染HepG2.2.15细胞和高表达KRT8基因的质粒转染HepG2.2.15细胞.RT-PCR验证转染效率,荧光定量PCR检测转染48小时后的细胞上清液HBV DNA水平.用拉米夫定抑制HepG2.2.15细胞HBV复制,RT-PCR检测基因表达水平.对数据采用t检验和方差分析,p<0.05为差异有统计学意义.结果:干扰KRT8基因表达后,HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA水平与对照组相比下降34%～38%(p<0.05).高表达KRT8基因后,HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA水平是对照组的28倍(p<0.01).抑制细胞HBV DNA复制后,HepG2.2.15细胞KRT8mRNA水平与对照组相比,下降了24%,但统计学无明显差异.结论:抑制宿主KRT8基因表达具有抗病毒作用.

关键词： KRT8 HBV复制宿主蛋白 RNA干扰

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第三军医大学学报 2012年第17期34卷 1733-1736页

作者：彭辉陈维贤常琳陈敏重庆医科大学附属第二医院检验科重庆400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学省部共建教育部重点实验室重庆400010

目的探讨HBV感染相关的慢加急性肝衰竭患者(HBV-associated acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF)外周血中TCRγδT(γδT)细胞的比例及产生IFN-γ、TNF-α及IL-17等促炎细胞因子的能力,分析它们与临床指标间的相关性。方法入选26... 详细信息

目的探讨HBV感染相关的慢加急性肝衰竭患者(HBV-associated acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF)外周血中TCRγδT(γδT)细胞的比例及产生IFN-γ、TNF-α及IL-17等促炎细胞因子的能力,分析它们与临床指标间的相关性。方法入选26例HBV-ACLF患者、40例慢性HBV感染患者(CHBV)、25例健康对照者,用流式细胞仪方法检测外周血中γδT细胞的频率及产生炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17细胞的比例,采用SPSS 13.0统计软件分析各组间各细胞比例的差异及细胞比例与临床指标的相关性。结果 HBV-ACLF患者外周血中γδT细胞占总T细胞的比例的中位值为4.8%,低于CHB患者(10.7%)与健康对照者(10.3%),差异有统计学意义(P<0.01)。在体外经刺激后,IFN-γ阳性的γδT细胞在HBV-ACLF组的比例中位值为73.9%、CHBV组为70.9%,高于健康对照组(45.3%,P<0.01);HBV-ACLF患者中TNF-α阳性的γδT细胞中位值为26.7%,显著高于CHBV患者(11.5%)及健康对照组(11.7%,P<0.01);产生IL-17因子的γδT在HBV-ACLF组中中位值为0.7%,高于CHBV组(0.3%)及健康对照组(0.3%,P<0.01)。经Spearman Correlation相关性分析,HBV-ACLF组中TNF-α+γδT细胞的比例与ALT或AST水平呈负相关。结论虽然HBV-ACLF患者外周血中总的γδT细胞比例降低,但产生炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17的能力显著增强,可能参与了HBV-ACLF发病过程中炎症因子急剧升高的过程。

关键词： γδT细胞慢加急性肝衰竭乙型肝炎病毒炎性因子

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转化生长因子β1的小干扰RNA对肝纤维化大鼠Smad蛋白表达的影响

转化生长因子β1的小干扰RNA对肝纤维化大鼠Smad蛋白表达的影响

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第八届全国肝脏疾病临床学术大会暨第四届中国-印度尼西亚肝病峰会

作者：孙银春钱克莉肖朗刘杞石小枫郎清重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室 40010 四川省达州市中心医院感染科

目的：研究转化生长因子(TGF)β 1的小干扰RNA(siRNA)对CCl4诱导肝纤维化大鼠TGF β 1/Smad信号通路的影响。方法：以前期研究的TGF β lsiRNA治疗前后肝纤维化大鼠肝脏组织作为研究对象，分为正常组、模型组、TGF β lsiRNA 0.125 mg/k... 详细信息

目的：研究转化生长因子(TGF)β 1的小干扰RNA(siRNA)对CCl4诱导肝纤维化大鼠TGF β 1/Smad信号通路的影响。方法：以前期研究的TGF β lsiRNA治疗前后肝纤维化大鼠肝脏组织作为研究对象，分为正常组、模型组、TGF β lsiRNA 0.125 mg/kg组、TGF β lsiRNA 0.25 mg/kg组和阴性对照组(0.25 mg/kg非特异性靶序列)。用免疫组织化学和Western blot检测Smad2、3、4、7的蛋白表达;Real-time PCR法检测Smad2、3、4、7的mRNA表达。结果：免疫组织化学结果显示TGF-β lsiRNA 0.25mg／kg组及0.125mg／kg组Smad2/3、4的蛋白表达量较模型组、阴性对照组明显减少(F值分别为115.538，117.178，p<0.01)，TGF-β lsiRNA0.25 mg／kg组较0.125 mg／kg组表达量少(p<0.05)。TGF—β 1 siRNA 0.25 mg／kg组及0.125 mg／kg组Smad7的蛋白表达量较模型组、阴性对照组增加(F=125.34，p<0.01)，TGF-β 1 siRNA 0.25mg／kg组较0.125 mg／kg组表达量多(p<0.05)，Western blot也显示相同趋势。Real-time PCR结果显示与模型组和阴性对照组比较，TGF β 1 siRNA可以明显抑制Smad2、3、4基因的表达，且TGF-β 1 siRNA 0.25 mg/kg组Smad2、3、4的mRNA表达量(分别为5.998±0.329，5.827±0.781，5.102±0.102)较TGF—β 1 siRNA 0.125mg／kg组(分别为2.870±0.705，2.904±0.414，2.667±0.466)明显减少(p<0.05)。TGF-β 1 siRNA 0.25 mg／kg组及0.125mg／kg组Smad7的mRNA表达量较模型组、阴性对照组增加(F=29.615，p<0.01)，TGF-β 1 siRNA 025mg/kg组较0.125 mg／kg组表达量多(p<0.05)。结论：TGF β lsiRNA干扰大鼠TGF β 1表达后，Smad2、3、4表达量明显降低，而Smad7表达仍维持在较高水平，这利于肝纤维化的改善。

关键词：肝纤维化转化生化因子β 小干扰核糖核酸 Smad蛋白蛋白表达

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转化生长因子β1及基质金属蛋白酶抑制剂1、2siRNA真核表达载体的构建与鉴定

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中华肝脏病杂志 2011年第4期19卷 291-296页

作者：钱克莉徐宁郎清戚敬虎孙银春肖朗刘杞石小枫重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室400010 陕西省榆林市第二医院重症医学科

目的用RNA干扰技术,分别以转化生长因子（TGF）β 1、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）的T... 详细信息

目的用RNA干扰技术,分别以转化生长因子（TGF）β 1、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）的TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况.方法设计合成TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体,并测序鉴定.体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率,并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的基因的抑制效率.组间比较用方差分析,两两比较用q检验.结果成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体.体外成功转染HSC-T6细胞,转染后的细胞TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%,64.5%±9.0%,55.0%±17.0%（F值分别为17.55、128.42、210.36,P值均＜0.01）,TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%（F值分别为130.75、159.09、35.72,P值均＜0.01）.结论成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体;将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并显著抑制了目的基因的表达;为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具.

关键词：肝硬化转化生长因子β 肝星状细胞

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荧光定量PCR法分析乙肝病毒基因型及载量

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重庆医科大学学报 2011年第7期36卷 829-832页

作者：刘琦曾爱中秦波赵耀胡接力黄爱龙重庆医科大学附属第一医院感染科重庆400016 重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所重庆400014 重庆医科大学教育部感染性疾病分子生物学重点实验室病毒性肝炎研究所重庆400016

目的：了解重庆地区乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）基因型的分布情况并进行精确定量分析。方法：采用荧光分型定量聚合酶链反应法（Real-time genotyping and quantitative PCR,GQ-PCR）对收集的血清标本进行HBV基因分型并定量... 详细信息

目的：了解重庆地区乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）基因型的分布情况并进行精确定量分析。方法：采用荧光分型定量聚合酶链反应法（Real-time genotyping and quantitative PCR,GQ-PCR）对收集的血清标本进行HBV基因分型并定量。结果：152株血清标本成功分型148株（97.37%）,其中B基因型109例（男88例、女21例）[定量值范围4-12 log10copies/ml、均值和标准差（7.94±1.44）log10copies/ml]、C基因型10例（男6例、女4例）[定量值范围5~10 log10copies/ml、均值和标准差（8.12±1.64）log10copies/ml]、基因B＋C混合型29例（男24例、女5例）[定量值范围4~10 log10copies/ml、均值和标准差（7.45±1.59）log10copies/ml]。检出率分别为73.65%（男74.58%、女70.00%）、6.76%（男5.08%、女13.30%）、19.59%（男20.34%、女16.70%）。结论：重庆地区HBV优势基因型以B型和B＋C混合型为主,与前几年相比较,C型有下降趋势。基因型的分布与性别无关（P〉0.05）。HBV载量在B、C型及B＋C混合型三者之间无统计学差异（P〉0.05）。荧光分型定量PCR（GQ-PCR）法灵敏度和特异性高,能够同时准确的对临床标本进行HBV基因分型及定量检测,并有望替代传统的基因分型方法。

关键词：乙型肝炎病毒 HBV基因型荧光定量PCR

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