检索结果-内蒙古大学图书馆

中国人兽共患病学报 2006年第6期22卷 575-579页

作者：郑南才黄宝明徐劲黄善盛胡旭初陈金中余新炳江门市疾病预防控制中心江门市529020 中山大学基础医学院病原生物学教研室复旦大学生命科学院遗传研究所基因工程国家重点实验室

目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质... 详细信息

目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性。结果H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63.5℃和64℃,比Cs cMDH的tm值分别下降了4℃和3.5℃。结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降。

关键词：华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶点突变圆二色性

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几种差异序列分析方法的比较及其研究前景

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生物技术通讯 2006年第6期17卷 1008-1010页

作者：李敏惠杨平曹月青成都医学院科研实验中心四川成都610083 成都医学院生物化学教研室四川成都610083 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心重庆400044

分离和鉴定不同生物基因的差异序列,有助于功能基因的分离,揭开物种间进化的规律,阐明某些疾病相关基因的作用机理。本文简述了几种近年来常用的筛选差异基因的方法,特别是最新发表的杂交监控差异分析法(HMDA)的原理、适用范围及其特点... 详细信息

分离和鉴定不同生物基因的差异序列,有助于功能基因的分离,揭开物种间进化的规律,阐明某些疾病相关基因的作用机理。本文简述了几种近年来常用的筛选差异基因的方法,特别是最新发表的杂交监控差异分析法(HMDA)的原理、适用范围及其特点,重点探讨了HMDA法在真核基因组差异序列筛选中的技术性突破及其研究前景。

关键词：基因组差异序列杂交监控差异分析法

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表达hIFNα-2b基因重组乳杆菌治疗HSV-2感染的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第4期20卷 324-326页

作者：陈辉张力平贾润清傅晓丽姚立红陈爱君康白袁杰利张智清首都医科大学病原生物学系北京100069 内蒙古医学院生化教研室美国Symbigene公司中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室大连医科大学微生态研究所

目的探讨表达人干扰素α-2b的重组乳杆菌应用于阴道HSV-2感染的治疗作用。方法建立阴道感染HSV-2的小鼠模型,使用重组菌菌液于感染前24h进行预防,或感染后48h进行治疗,记录病损程度并检测小鼠阴道分泌物中HSV-2滴度。结果使用重组菌预... 详细信息

目的探讨表达人干扰素α-2b的重组乳杆菌应用于阴道HSV-2感染的治疗作用。方法建立阴道感染HSV-2的小鼠模型,使用重组菌菌液于感染前24h进行预防,或感染后48h进行治疗,记录病损程度并检测小鼠阴道分泌物中HSV-2滴度。结果使用重组菌预防或治疗的小鼠症状轻且病程缩短,病灶中病毒滴度下降很快。结论表达IFNα-2b的重组乳杆菌具有较强的局部抗病毒作用,可用于预防及治疗由HSV-2感染引起的生殖器疱疹。

关键词：干扰素α-2b 乳杆菌属单纯疱疹病毒属阴道炎

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耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

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微生物学报 2005年第4期45卷 543-546页

作者：谭秀华武玉永马立新蒋思婧湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室武汉430062 滨州医学院细胞生物学教研室滨州256603

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一... 详细信息

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。

关键词：甘露聚糖酶,克隆,毕赤酵母,表达,酶活

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人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

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广东医学 2005年第11期26卷 1473-1475页

作者：汪宗桂郑文岭马文丽梁念慈广东医学院生化教研室广东湛江524023 华南基因组研究中心广州510800 南方医科大学基因工程研究所广州510515

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳... 详细信息

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。

关键词：酿酒酵母穿梭载体哺乳动物人生长激素口服基因治疗动物细胞表达酵母表达载体 HGH 基因药物 ECHO 引物扩增序列测定药物研制启动子 CMV PCR 复制调控酶切

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华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的功能鉴定

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中国人兽共患病杂志 2005年第10期21卷 863-866页

作者：徐劲郑南才吴忠道陈守义胡旭初应康余新炳中山大学基础医学院病原生物学教研室复旦大学生命科学院遗传研究所基因工程国家重点实验室

目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目... 详细信息

目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目的片段,与表达质粒pGEX-4T-1连接构建重组质粒,IPTG诱导表达;研究重组蛋白的理化性质及酶动力学特征,并寻找可能的抑制剂。结果成功表达出约64 kDa的重组蛋白,凝血酶切后为36 kDa蛋白,其酶活性为63.6U/mg。1.14 mM 4,4′-二甲氨基联苯甲醇处理30 min酶活性下降了60%;吡喹酮、灭滴灵和阿苯哒唑对酶活性无抑制作用;而5’-单磷酸腺苷对重组酶有竞争性抑制作用,其Ki为0.49。结论成功地表达了目的蛋白,为药物筛选提供了一个易于获得的候选蛋白分子。

关键词：华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶异源表达酶动力学参数抑制

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表达HPCagA基因非复制型重组腺病毒的构建

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中国病理生理杂志 2005年第10期21卷 1981-1985页

作者：王璇刘金保赵小东吴淑华董伟华陆丽广州医学院病理生理学教研室广东广州510182 中国疾病控制中心病毒病控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

目的:构建表达幽门螺杆菌CagA基因的非复制型重组腺病毒,从而为探讨表达HeCagA的重组腺病毒对哮喘TH1／TH2细胞因子的调控作用,获得防治哮喘的新方法奠定基础。方法:通过PCR扩增幽门螺杆菌CagA 基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV... 详细信息

目的:构建表达幽门螺杆菌CagA基因的非复制型重组腺病毒,从而为探讨表达HeCagA的重组腺病毒对哮喘TH1／TH2细胞因子的调控作用,获得防治哮喘的新方法奠定基础。方法:通过PCR扩增幽门螺杆菌CagA 基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化*** BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。结果和结论:成功构建了幽门螺杆菌CagA的非复制型重组腺病毒。

关键词：哮喘螺杆菌,幽门基因,CagA 腺病毒

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用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段(英文)

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贵阳医学院学报 2005年第1期30卷 4-9页

作者：杨平夏玉先苏晓庆贵阳医学院生物学教研室贵州贵阳550004 重庆大学基因工程中心重庆400030

目的:分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法:采用 PANHANDLEPCR,以基因组DNA为模板,通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构,经嵌套式PCR 扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段... 详细信息

目的:分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法:采用 PANHANDLEPCR,以基因组DNA为模板,通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构,经嵌套式PCR 扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物,PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列,采用限制性内切酶BamHⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,经去磷酸化处理后,在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA,经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果:获得一大小为876bp的PCR产物,经序列分析验证,该panhandlePCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论:这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。

关键词：聚合酶链反应克隆,分子灭蚊害虫防治,生物学枯草杆菌蛋白酶碱基序列枯草菌素类蛋白酶卡地腐霉

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卡地腐霉Pr1蛋白酶miniDNA文库的构建及基因片段的克隆

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贵阳医学院学报 2005年第2期30卷 95-98,107页

作者：杨平夏玉先苏晓庆贵阳医学院生物学教研室贵州贵阳550004 重庆大学基因工程中心重庆400030

目的: 在本实验室已克隆得到的灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因的部分序列的基础上,继续分离该基因的全基因组序列。方法:采用构建卡地腐霉mini基因组文库的方法,首先利用已知序列设计引物,克隆得到该蛋白酶基因的部分基因组序列... 详细信息

目的: 在本实验室已克隆得到的灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因的部分序列的基础上,继续分离该基因的全基因组序列。方法:采用构建卡地腐霉mini基因组文库的方法,首先利用已知序列设计引物,克隆得到该蛋白酶基因的部分基因组序列;然后采用限制性内切酶XhoⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,同时用该内切酶消化质粒pBluescriptSK( -),经去磷酸化后,将基因组酶切产物克隆到载体上并转化到大肠杆菌JM109中,构建mini基因组文库。利用载体上的通用引物和根据已知序列设计的引物,进行嵌套式PCR。结果:获得一780bp的PCR产物,经克隆、测序和分析为卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知序列一端301bp未知序列。结论:这种方法操作简便,实验周期短,能够特异地扩增与已知位点相邻的基因组DNA。

关键词：卡地腐霉基因组,真菌聚合酶链反应枯草杆菌蛋白酶类

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重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

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中华麻醉学杂志 2005年第1期25卷 34-36页

作者：杨辉田玉科王鹏安珂高峰吴小兵梅伟华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室武汉市430030 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室

目的构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载... 详细信息

目的构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。

关键词：重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体转基因镇痛实验研究

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